Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

• Автор: Зацепина, Ольга Георгиевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 207 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика ответа клеток и организмов на

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Структура и эволюция генов ТШ

1.4. Регуляция экспрессии генов ТШ

1.5. Роль белков ТШ в адаптации к условиям внешней среды и эволюции

1.6. Изучение роли БТШ в термальной адаптации на модели i

1.7. Экспрессия генов при изменении условий окружающей среды

1.8. БТШ в медицине
1.9. Мобильные элементы как возможный фактор эволюции генов ТШ
1.9.1. Особенности Р элемента и его использование в инссрционном мутагенезе
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Виды ящериц
2.1.2. Линии и виды i
2.1.3. Штаммы Е. i
2.1.4. Клоны 6i .
2.1.5. Ферменты рестрикции
2.1.6. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов
транскрипции с элементами ГШ
2.1.7. Антитела
2.2. Методы
2.2.1. Условия содержания дрозофилы
2.2.2. Условия теплового шока
2.2.3. Определение базальной и индуцируемой термоустойчивости
2.2.4. Включение метионинав белки
2.2.5. Подсчт общего включения 8метионина в белки
2.2.6. Дискэлсктрофорез белков с ДДС по Лэммли
2.2.7. Двумерный электрофорез белков по ОФарреллу
2.2.8. Иммуноблоттинг
2.2.9. Иммунопреципитация
2.2 Очистка белков методом препаративного электрофореза
2.2 Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных
2.2 Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ
2.2 Включение радиоактивной метки в ДНК
2.2 Выделение геномной ДНК
2.2 Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.2 Электрофорез ДНК
2.2 Перенос и гибридизация по Саузериу
2.2 Определение числа копий гена по Саузерну
2.2 Выделение тотальной РНК
2.2 Электрофорез РНК
2.2 Нозернгибридизация
2.2 Получение геномных фаговых библиотек
2.2 Скрининг фаговых геномных библиотек
2.2 Выделение ДНК бактериофаг а X
2.2 Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов
2.2 Выделение фрагментов ДНК
2.2 Клонирование фрагментов ДНК
2.2 Трансформация компетентных клеток
2.2 Выделение плазмидной ДНК
2.2 Модель генетического анализа
2.2 Определение фертильности трансгенных мух
2.2 Иммунофлуоресцентное окрашивание транскрипционных факторов
2.2 ПЦРанализ
2.2 Секвенпрование ДНК
2.2 Количественный ПЦРанализ в реальном времени ц1ТГРСК.
2.2 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре обитания экологических ниш
3.1.1. Экспрессия БТШ и у ящериц
3.1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами
теплового шока
3.2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни и области с умеренным климатом
3.3. Внутривидовые различия по термоустойчивости на примере
i
3.3.1. Сравнение линийпо термоустойчивости
3.3.2. Сравнение уровняэкспрессии БТШ
3.3.3. Анализ геномной ДНК линий ТТ и
3.3.4. Анализ синтеза белков при тепловом шоке
3.4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов 6тш у видов фнлады viii, с различной термальной адаптацией
3.4.1. Изучение термоустойчивости
3.4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и
линий группы viii
3.4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов
. viii и i
3.4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у . viii и . i
3.4.5. Накопление БТШ при тепловом шоке
3.4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ
3.4.7. Исследование ДНКсвязывающей активности
3.4.8. Анализ спектра изоформ БТШ
3.4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы viii
3.4 Вклад нмБТШ в термоустойчивость
3.4 Анализ структу ры кластера генов бтш . viii и . i
3.4 Определение числа копий гена бтш у разных линий . viii и . i
3.4 I i гибридизация с политенными хромосомами . viii и . i
3.4 Определение структуры кластера генов бтхиУО . viii и . i на основе рекомбинантных фагов X
3.4 Определение нуклеотидной последовательности генов бтш и прилежащих участков . i и . viii и .
3.5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтш
3.5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтиПО методом Ринссрционного мутагенеза
3.5.2. Идентификация инсерций 2 методом Саузернблот анализа
3.5.3 Точная локализация полученных инсерций 2
3.5.4. Влияние инсерций 2 на уровень транскрипции бтш
3.5.5. Анализ синтеза БТШ в трансгенных линиях
3.5.6. Анализ инсерций 2, сопровождающихся перестройками геномной ДК
3.5.7. Базальная и индуцированная термоустойчивость трансгенных линий
3.5.8. Определение плодовитости потомства трансгенных линий
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Выводы
Список литературы


Наиболее значительные изменения в накоплении БТШ наблюдаются при старении мух. Концентрация БТШ увеличивается до раз в голове и в раз в тораксе . Показано, что БТШ является одним из основных факторов, защищающих митохондрии от последствий оксидативного стресса и при старении мух . Эксперименты последних лет, проведенные на дрозофиле, показали, что повышенная экспрессия нмБТШ способствует лучшей устойчивости насекомых к разным видам стресса, а также увеличивает продолжительность жизни. Так, мухи, в организме которых не синтезировался БТШ, были более чувствительны к стрессу средней интенсивности и характеризовались более короткой продолжительностью жизни. БТШ экспрессируется в митохондриях, которые особенно чувствительны к оксидативному стрессу . При исследовании шаперонной активности методом восстановления первичной структуры денатурированной при С люциферазы в присутствии лизата кроличьх ретикулоцитов были выявлены различия в активности разных нмБТШ. Люцифераза восстанавливает нативную сгруктуру в тесте с БТШ на , БТШ и БТШ на , а БТШ на . Интересно, что наибольшей активностью обладает БТШ, локализующийся в митохондриях, чьи белки особенно чувствительны к стрессу i . Однако различия, возможно, обусловлены разницей в связывании нмБТШ с определенными субстратами в часносги с люцефезазой при С . БТШ относится к группе так называемых бслков, по их гомологии с белком . Да. Он обладает шаперонной активностью может связываться с белками, лишенными нативной конформации и предотвращать их агрегацию, а также является кошапероном БТШ. В настоящее время у человека найдено несколько десятков представителей семейства белков . Их объединяет наличие концевого домена, необходимого для взаимодействия с БТШ. БТШ стимулирует АТФазную активность БТШ, посредством взаимодействия домена с АТФазным доменом БТШ. Он также, стабилизирует комплекс БТШ с субстратом . Кроме концевого домена, БТШ содержат Сконцевой шапероннын домен, который связывается с денатурированными белками. У . БТИ0 , , . БТШ представляют собой необычное семейство стрессовых белков, выделяемое в особую группу шаперонинов. К ним относятся бактериальный , митохондриальный БТШ, эукариотический цитозольный ССТ и БТШ архебакгерий. ССТ не требует белковых кофакторов для функционирования. БТШ нуждаются в кофакторах или БТШ. Он гомологичен эукариотическому и также не требует кофактора i . Основная особенность шаперонинов и отличие их от шаперонов заключается в том, что они формируют сложные структуры в виде стопки из двух колец, каждое из которых состоит из 7и мономеров массой кДа. В центре кольца между мономерами имеется внутренняя пора, в которой и происходит фолдинг белковсубстратов В аминокислотной последовательности каждого из мономеров присутствует несколько остатков. С этими гидрофобными остатками взаимодействуют белкисубстраты, фолдинг которых, как и в случае шаперонов, требует гидролиза АТФ. В случае захват денатурированного белка внутрь поры. АТФЗатем диссоциирует, и происходит высвобождение восстановленного белка. Семейство БТШ эго наиболее изученное и многочисленное семейство белков теплового шока, занимающее центральное место в защите клетки в условиях стресса. Оно содержит много членов, выполняющих различные роли в отдельных, клеточных компартаментах, в нормальных условиях и при стрессе. В одной клетке млекопитающих можно обнаружить одновременно несколько представителей семейства БТШ. В цитозоле находятся белки БТШ, БТШ, БТШ, а также конститутивный i, i, . В митохондриях постоянно присутствует гомолог БТШ i . В ЭПР , или i белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов, Ii v i ii i. В лизосомах конститутивный , . В бактериях имеется всего один ген семейства БТШ, кодирующий белок . В дрожжах . Каг2 локализуется в ЭПР, в митохондриях, 4 цитозольные белки, причем , 2 конститутивные, 3, 4 индуцибельные, и , 2 в цитозоле Маргулис, i, . В геноме . БТШ, один ген етрессиндуцибельного белка БТШ, и 7 когнатных генов, чьи продукты выполняют различные функции в клетке при нормальных условиях. БТШ является наиболее хорошо изученным из всех стрессовых белков.