Клонирование и характеристика новых генов нейропептидов виноградной улитки

• Автор: Потеряев, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений Введение

Обзор литературы

Структурные особенности молекул предшественников нейропептилов Процессинг полипротеинов
Совместное хранение и секреция пептидных котрансмиттсров Сортировка нейропептилов в зависимости от типа клеток. Механизмы, регулирующие пептидный состав в больших электрон плотных везикулаях

Эаминокислоты в пептидах животных г ,

5.1 Краткая история вопроса

5.2 Встречаемость и разнообразие

5.3 Биосинтез пептидов, содержащих Эаминокислоты

5.4 Значение Оаминокислот

Роль нейропептидов в половом поведении моллюсков Семейство педального пептида Материалы и методы Материалы
Выделение суммарной РНК из органов улитки
Радиоактивнок мсченис ДНКзонда с помощью случайной затравки
Полимеразная цепная реакция
Получение неамплифицированных полноразмерных библиотек кДНК ЦНС виноградной улитки
Спасение рекомбинантной плазмиды из бактериофага Х7ЛР II
7. Выделение плазмидной ДНК
8. Приготовление делеционных мутантов клонов кДНК для секвенирования
9. Приготовление компетентных клеток Е. сой и их трансформация
рекомбинантными плазмидами
. Опрслеленис нуклеотидной последовательности кДНК
. Синтез меченых дигоксигенином РНКзондов
. I i гибридизация с целыми ЦНС виноградной улитки
. Оптическая регистрация активности идентифицированных нейронов
. Экспрессия рекомбинантного белка 2
. Выделение белка с i с помошыо i2 агарозы
. Препаративное выделение белка с i i2 хелатной колонке i с помощью
. Детекция изменения электрофоретической подвижности 2 при связывании
Результаты и их обсуждение Клонирование генов нейропептидов, обладающих регионспецифичной экспрессией в ЦНС вино1радной улитки
Часть I. , структура и функции
1. Структура белка, кодируемого геном
2. Экспрессия гена
3. Физиологические эффекты и
4. Природные пептиды, содержащие аминокислоты
5. Клеточные основы сексуального поведения виноградных улиток и
6. Поведенческие эффекты
7. Иерархия поведений у вино1радной улитки
8. Нейрофизиологические эффекты
9. Сосуществование и других нейропептидов и биоаминов
Часть II. Педальный пептид, его предшественник и экспрессия
1. Клонирование кДНК педального пептида
2. Структура белкапредшественника педального пептида ix
3. Экспрессия гена ПРер во взрослых животных
4. Экспрессия гена ПРер в онтогенезе
5. Экспрессия гена НРер в периферической нервной системе
6. Экспрессия гена НРер после стрессовых воздействий
7. Связь организации предшественника Рер с его возможной функцией
8. Рер как вероятный котрансмиттер
9. Рер возможно играет определенную роль в развитии и пластичности нервной системы
Часть Ш. 2 как уникальный гибридный белок
1. Физиологические действие пептидов кодируемых гоном 2
2. Значение и функциональность домена белка 2
3. Экспрессия рекомбинантного белка 2 и проверка способности его
домена связывать Са2
Заключение и выводы
Список цитируемой литерату ры
Благодарности
Список сокращений
БЭГ1В большие электронплотные везикулы
ВСР бромохлороиндолилфосфат
2 ix ii
i i
конец аминоконец
i
i
i i i
ТЕ ТрисЭДТА буфер
X бромохлороиндо ли лгал акто иранозид
ЬСА бычий сывороточный альбумин
ГОЯ гормон откладки яиц
ДМСО диметилсульфоксид
дНТФ дезоксирнбонуклеотидтрифосфаг
ДСААГ додецилсульфат натрия полиакриламидный гель
ДТТ дитиотрейтол
ИПТГ изопроиилтиогалакгопиранозид
Кб 1.0 пар оснований
кД килодальтон
к ДНК ДНК, комлимептарная мРНК мРНК информационная РНК ОцДНК одноцепоцечная ДНК ПЦР полимерпзная цепная реакция
Рер педальный пептид
Сконец карбоксиконец
ТрисборатЭД ГА буфер
Трис трисаминометан
ЦНС центральная нервная система
ЭГТА этиленгликольбисаминоэтилтетраацетат
ЭДТА этилендиаминтетраацетаг
Введение


В дальнейшем, после выделения двух эндогенных опиоидных пептидов, являющихся лигандами морфиновых рецепторов . НОВЫХ ПОДХОДОВ К проблеме боли. Кроме ТОГО, было обнаружено, 0 пептиды участвуют и в других функциях нервной системы и высшей нервной деятельности, включая сознание. Например, вазопрессин влияет на научение и память i, . Нсйропсптиды заставили по новому взглянуть на биохимическое разнообразие нейронов. В частности, открытие сосуществования в одном нейроне пептида соматостатина и классическою низкомолекулярного медиатора норадрсналина . Если так, действительно ли нейроны выполняют какието другие функции в нервной системе, кроме быстрой передачи сигналов Ответы на эти и другие вопросы позволяли надеяться, что исследования пептидов могут многое добавить к нашему пониманию функционирования мозга. Наши знания о распределении нейропептидов, их сосуществовании и их биологической активности постоянно увеличивались в течение последних двух десятилетий. Разработка новых антагонистов пептидов позволила анализировать физиологическую роль нейропептидов. Вдобавок к их вспомогательной роли в синаптической и несинаптической передаче, появлялось все больше данных об их трофическом действии. Концепция котрансмиссии получила дальнейшее определение после установления того, что химическая трансмиссия или передача сигнала дополнительно настраивается путем высвобождения быстрого трансмиттера и пептида в частотнозависимой манере. Таким образом, пептиды редко высвобождаются в базальных условиях, но их выброс происходит только при высокочастотной активации или залповой активности нейронов. В отдельных случаях, иейропептиды ифают свою роль, когда нейроны повреждены или испытывают другие условия сильного стресса. На самом деле, они могут даже синтезироваться в таких условиях, проявляя высокую степень пластичности. Прогресс в понимании биологического значения неропептидов был достигнут не только в исследованиях млекопитяющих. Па самом деле, многие беспозвоночные оказываются даже более удобными моделями в определенных аспектах клеточной и молекулярной нейробиологии и, в частности, в изучении структуры и действия нейропептидов. Нервная система виноградной улитки ix является полезной моделью для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе свойств и функционирования отдельных нейронов и небольших нейронных групп. ЦНС ix содержит относительно небольшое количество нейронов и обладает структурной простотой, вследствии этого она была детально изучена и картирована Балабан и Захаров, . В той или иной степени настоящая диссертация дает ответы на эти вопросы. Структурные особенности молекулпрсдшсствешшков нейропептидов. Все нейропептиды сначала появляются в клетке в виде пропептидов, более длинных белковых молекул, содержащих наряду с собственно активным пептидом спейсерные участки, которые подвергаются деградации при протеолитическом процессинге. Данный механизм является эволюционно консервативным, и сейчас охарактеризованы десятки нейропептидов у различных организмов, включая таких эволюционно удаленных, как моллюски и человек. Каковы же наиболее общие структурные свойства пропептидов Несмотря на эволюционное разнообразие, практически все предшественники нейропептидов содержат сигнальные пептиды, представляющие собой концсвую последовательность из гидрофобных аминокислот. Сигнальные пептиды направляют синтезируемый белок в пространство эндоплазматичсско о рстикулума, откуда начинается путь движения секретируемых белков. Первое протеолитическос расщепление происходит там же от пропептида отщепляется сигнальный пептид, который затем быстро деградирует. Однако, некоторые секретирусмые белки не содержат отщепляемые сигнальные пептиды. Отсутствие подобной последовательности описано для пронептида амида у морского моллюска аплизии , , для предшественника интерлейкина 1, белка, секретируемого макрофагами i , , и ряда других белков. Предполагается, что подобные нропептиды содержат внутренние последовательности гидрофобных аминокислот, которые могут выполнять функцию сигнального пептида, но его отщепление при этом не происходит.