Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика

• Автор: Сударкина, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Белки, инактивирующие рибосомы

2. Структура I 2

3. Действие I на рибосомы

4. Биосинтез рицина

5. Взаимодействие I 2 с клетками млекопитающих

5.1 Поступление I 2 в цитоплазму клеток

5.2 Ответ клетки на воздействие I 2

6. Биологическая роль и практическое применение 1 2
7. Токсические лектины омелы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Растительный материал
2. Выделение мРНК из растения и синтез кДНК
3. Амплификация фрагментов геномной ДНК, кодирующих токсические лектины омелы с помощью вырожденных праймеров
4. Амплификация концов к ДНК
5. Клонирование полных кодирующих последовательностей генов токсических лектинов омелы
6. Выделение геномной ДНК омелы и Саузернблот анализ
7. Оценка количественного соотношения трех генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК
8. Количественная ПЦР
9. Секвенирование ДНК
. Конструкция экспрессионных плазмид, кодирующих рекомбинантные А и Вцепи лектинов омелы
. Синтез А и Вцепей токсических лектинов омелы в . i.
. Выделение рекомбинантных А и Вцепей токсических лектинов омелы
. Вестернблот анализ рекомбинантных Ацепей
. Каталитическая активность рекомбинантных Ацепей
. Приготовление поликлональной антисыворотки к Вцепи 2
. Лектиновые свойства рекомбинантных Вцепей
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Клонирование полных кодирующих участков генов токсических лектинов омелы и анализ структуры кодируемых белков
2. Количественное соотношение трех вариантов генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК
3. Количественное содержание генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК
4. Получение рекомбинантных Ацепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности
5. Получение рекомбинантных Вцепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
выводы
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Было показано, что токсины этого типа способны доставлять сшитые с ними чужеродные белки и пептиды в цитоплазму клеток, что делает возможным использование их для доставки различных антигенов в клетки для презентации, связанной с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости и индукции протективного клеточного иммунитета при вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях. В настоящее время экстракты омелы белой Vi широко используются в Европе для общей иммуностимуляции при онкологических заболеваниях. Три токсических лектина I, II и III, различающиеся но углеводной специфичности и цитотоксичности, являющиеся действующим началом этих экстрактов, в малых дозах стимулируют иммунную систему к продукции цитокинов, таких как интерлейкин1 и 6, интерферону и фактор некроза опухоли а, индуцируют цитотоксическую активность Тлимфоцитов и естественных киллеров, усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов. Вцепи. Иммуностимулирующее действие может увеличивать эффективность цитотоксических и вакцинных препаратов на основе лектинов омелы. Получение рекомбинантных лектинов необходимо для их практического применения и структурнофункциональных исследований. До недавнего времени была известна только первичная структура количественно преобладающего в растении лектина МЫ. Целью данной работы было клонирование генов токсичеких лектинов омелы и характеристика функциональных свойств их каталитических и лектиновых субъединиц. В работе представлены следующие результаты. Клонированы три варианта генов токсических лектинов омелы, два из которых кодируют МЫ, структура гена которого к началу работы не была известна, и МЫН, аминокислотная последовательность которого была недавно определена. Третий вариант, предположительно, соответствует МЫ1, данных о структуре которого в литературе пока нет. Впервые получены оценки размера семейства генов токсических лектинов и генома омелы. Получены энзиматически активные рекомбинантные Ацепи, которые могут быть использованы для разработки цитотоксических препаратов направленного действия. Полученные рекомбинантные Вцени, кодируемые тремя вариантами генов, обладают сниженным сродством к моносахарам галактозе и Иацетилгалактозамину, но связываются со сложными олигосахридами асиалофстуина и могут обладать той же биологической активностью, что и природные Вцепи. Растительным белкам, обладающим способностью инактивировать рибосомы I, iiivi i принадлежит важная и интересная роль в истории биомедицинских исследований. В конце девятнадцатого века было установлено, что известные с древних времен ядовитые свойства семян клещевины ii i и розарийного горошка i обусловлены белками. Тогда же обнаружили способность этих белков рицина из клещевины и абрина из розарийного горошка индуцировать агглютинацию эритроцитов и преципитацию белков сыворотки крови, что и считали причиной токсического действия 1. В это же время Пауль Эрлих, иммунизируя животных рицином и абрином, открыл специфичность иммунитета. Он обнаружил появление в сыворотке крови специфических белков, прсципитирующих токсин, что легло в основу гуморальной теории иммунитета. Интенсивные исследования структуры и механизма действия токсинов начались с г. Эрлиха, чем для нормальных клеток и, следовательно, могут найти применение в терапии опухолей 2,3. К настоящему времени охарактеризовано обширное семейство белков, обладающих способностью ферментативно инактивировать рибосомы. Способность гидролитически выщеплять инвариантный аденин из высоко консервативной области рРНК гликозидазная активность является характерным признаком белков этого семейства. Семейство I разделяют на два типа. I типа 1 далее 1 мономерные белки, такие как антивирусный белок лаконоса , ivi i и трихосантин, определяющий абортирующее действие препаратов китайского огурца i iiii. IР1 широко распространены у растений, а также были обнаружены у грибов и водорослей. К настоящему времени известно более белков этого типа 4.