РНК и неструктурный белок NS4 вируса гепатита C в печени и периферической крови больных хроническим гепатитом C

• Автор: Лакина, Екатерина Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1, Общие сведения о вирусе гепатита С

1.1. Вирус гепатита С строение, распространенность

и пути передачи

1.2. Клиническое течение гепатита С

1.3. Патологические изменения в печени при гепатите С

Глава 2. Молекулярная организация и иммунологические

свойства вируса гепатита С

2.1 .Организация вирусного генома
2.2. Структура и функции вирусных белков
2.3. Гуморальный и клеточный иммунные ответы при ВГСинфекции
Глава 3. Молекулярные основы диагностики гепатита С
3.1. Выявление антител к белкам ВГС
3.2. Детекция РНК ВГС
3.3.Выявление вирусных белков
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава 4. Материал от больных
Глава 5. Детекция РНК вируса гепатита С
5.1. Выделение РНК ВГС
5.2. Детекция геномной РНК ВГС
5.3. Выявление репликативной формы РНК вируса гепатита С.
Глава 6. Получение МКА к рекомбинантному белку
вируса гепатита С
6.1. Рекомбинантный белок 4 вируса гепатита С
6.2.Синтегические петиды
6.3. Иммунизация
6.4. Миеломная клеточная линия
6.5. Культивирование клеток
6.6. Слияние клеток и выращивание гибридом
6.7. Скрининг гибридом
6.8. Криоконсервирование гибридом
6.9.Получение асцитных жидкостей, содержащих МКА
6Выделение МКА из асцитных жидкостей
6. .Определение концентрации белка
6 Субтипирование МКА и определение типов
легких цепей в составе иммуноглобулинов
6 Твердофазный ИФА
6 Иммуноблот
6 Эпитопное картирование МКА
6 Конкурентный тИФА Глава 7. Детекция белка 4 ВГС i i
7.1. Приготовление препаратов изолированных клеток
7.2. Получение криостатных срезов печени
7.3. Выделение лимфоцитов из цельной крови
7. 4. Непрямой иммунофлюоресцентный анализ нИФ
7.5. Непрямой иммуноферментный анализ i i
Глава 8. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 9. Выявление РНК ВГС
9.1 .Выявление геномной РНК ВГС
9.2. Детекция минусРНК ВГС
9.3.Выявление РНК ВГС после интерферонотерапии
Глава . Получение и характеристика МКА
.1. Слияние и скрининг гибридом
.2. Характеристика МКА к белку
Ю.З.Эпитопная специфичность МКА
.4. Реципрокный конкурентный анализ МКА
Глава . Выявление натурального белка ВГС
.1. Детекция в изолированных инфицированных гепатоцитах
.2. Изучение экспрессии белка ВГС на криостатных срезах печени
.3. Выявление белка в лимфоцитах периферической крови
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Изучение РНК и белков ВГС непосредственно в печени органе, в котором происходит активная репликация вируса необходимо как для решения задач практического здравоохранения, гак и ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии вируса и патогенеза гепатита С. Многие вопросы, связанные с данным заболеванием, остаются нерешенными. В частности, не ясен механизм персистенции вируса и повреждения клеток печени . Активно обсуждается связь между накоплением РНК и белков вируса и активностью патологического процесса. Открытым остается вопрос о внепеченочной репликации ВГС. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы состояла в изучении частоты определения геномной и антигеномной форм РНК ВГС в печени и периферической крови сыворотке и лимфоцитах больных с различной активностью хронического гепатита С ХГС и в разработке метода выявления белка в организме больных с помощью моноклональных антител МКА. Исследовать частоту выявления геномных и антигеномных цепей РНК ВГС в сыворотках крови, лимфоцитах периферической крови и печени больных с разными формами и стадиями ХГС. Провести статистический анализ полученных результатов для оценки связи между частотой выявления РНК ВГС и активностью патологического процесса. Получить гибридомные клеточные линии, продуцирующие МКА к рекомбинантному белку ВГС. Исследовать способность полученных МКА взаимодействовать с натуральным антигеном в клетках печени больных ХГС. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Установлено, что положительные цепи РНК плюсРНК ВГС достоверно чаще выявляются в печени, чем в периферической крови в сыворотке крови и лимфоцитах больных ХГС. Отрицательные цепи минусРНК ВГС обнаружены в ткани печени и не обнаружены в лимфоцитах периферической крови больных ХГС. Показано, что прогрессирование поражения печени сопровождается уменьшением частоты выявления минусРНК ВГС, что может свидетельствовать о подавлении репликации вируса при серьезных воспалительных процессах в печени. В печени части пациентов после интерферонотераиии обнаружена РНК ВГС при отсутствии этого маркера в сыворотке, что свидетельствует о необходимости определения вирусной РНК в печени после лечения. Получена панель моноклональных антител, выявляющих 5 индивидуальных антигенных детерминант неструктурного белка ВГС. Разработан метод выявления белка ВГС в криостатных срезах печени больных ХГС на основе полученных моноклональных антител. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Установлено, что частота выявления РНК ВГС максимальна в ткани печени и значительно ниже в сыворотке крови больных ХГС. В лимфоцитах периферической крови антигеномная форма РНК ВГС не выявлена. Получено 6 гибридом, продуцирующих МКА, направленные к пяти антигенным детерминантам белка ВГС. Показана принципиальная возможность выявления вирусного белка в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью полученных МКА. ГЛАВА 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ГЕПАТИТЕ С. С развитием специфической диагностики гепатитов А и В в семидесятые годы стало очевидным, что большая часть случаев гепатита, связанного с гсмотрансфузиями, не обуславливается инфицированием какимилибо известными в то время гепатотропными агентами 1. Несмотря на более, чем десятилетние исследования, агент, ответственный за так называемый посттрансфузионный гепатит ниА, ниВ оставался неиндетифицированным. Впоследствии было установлено, что основным этиологическим агентом является вирус, названный вирусом гепатита С, легко передающийся шимпанзе при инокуляции крови больного человека . К настоящему моменту установлено, что диаметр вирусной частицы составляет 3 нм, коэффициент седиментации не менее 0 . Установлено различие в плавучей плотности ВГС, полученного i viv и i vi. Считают, что более низкая плавучая плотность ВГС, полученного i viv, определяется его ассоциацией с липопротеинами низкой плотности, что может способствовать проникновению вируса в гепатоцит. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с высокой плавучей плотностью 1, гсм3 связывают с наличием комплекса ВГС с антителами 1.