Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4

• Автор: Альперн, Даниил Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гепатоцитарный ядерный фактор 4.

Структура и функции 4.

Структура белка.

Структура гена и изоформы.

Модуляция трансактивационных функций изоформ.
Функции 4.
Метаболизм
Клеточная адгезия и морфогенная активность
Регуляция клеточного цикла
Дифферснцировочный фактор.
Г спатоканцерогенез.
Специфичность экспрессии и роль 4 на отдельных этапах онтогенеза
Ранний эмбриогенез
Поздний эмбриогенез и взрослый организм.
Регуляция экспрессии гена 4.
Регуляция активности промотора Р1.
Регуляция активности промотора Р2.
Факторы, участвующие в регуляции экспрессии 4.
Печеньспецифические факторы транскрипции
СЕВР.
x 3.
6 .
.
Нетканесиецифические аспекты регуляции активности 4.
Опухолевый супрессор р
Участие белка р в процессе клеточной дифференцировкн
Последствия инактивации р у мышей.
Негативная регуляция АФГ1 белком р
Негативная регуляция экспрессии 4 белком р
Трансформирующий фактор роста
лиганд.
Рецепторы
Белки
сигнальный путь
Альтернативные сигнальные пути
зависимая регуляция экспрессии 4.
Кооперация р и сигнальных путей
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Список использованных растворов и сред
Животные
Клеточные линии.
Плазмидные конструкции
Трансформация клеток Е. СоН.
Трансфекция и инфекция клеток линии Нср.
Анализ активности репортерного гена люциферазы
Выделение РНК.
Выделение высокомолекулярной геномной ДНК.
Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК
Полимеразная цепная реакция ПЦР с обратной транскрипцией ОТ.
Клонирование промоторного участка Р2 гена НЫР4а мыши
Клонирование промоторного участка Р2 гена ШЯР4а человека и направленный
мутагенез.
Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов.
ВестернБлот гибридизация.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
В печени взрослых р мышей происходит активация экспрессии эмбриональной
изоформы Н4а7
Инактивация р в культуре клеток Нср при помощи миРНК приводит к
индукции экспрессии Н4аР2
Снижение уровня р вызывает активацию промотора Р2 в культуре клеток
Биоинформатический анализ нуклеотидной последовательности промоторного
элемента Р2 гена ЬЫГ4а мыши и человека.
Действие цитокшюв Тврр и Тврр2 проводит к изменению баланса
экспрессируемых изоформ НЫР4а в культуре клеток НерС2.
Компоненты ГСРр сигнального пути активируют промотор Р2 напрямую, в то время как репрессия промотора Р1 происходит опосредованно дополнительными
факторами.
Факторы ШРР1 и Тр2 способны активировать экспрессию репортерного
гена под контролем Р2 промотора ЬЮТ4х мыши.
Ингибирование передачи сигнала от рецептора ТвБр препятствует подавлению
синтеза 1ЮТ4аР1 и активации НМР4аР2.
Направленный мутагенез предполагаемого сайта связывания Бтас в промоторе Р2 гена Ш4Е4а человека не приводит к изменению активности этого промотора
под действием ТСБр2.
Ингибирование МЕК сигнального пути блокирует ТОррзависимое подавление
экспрессии изоформ ГО1Р4аР1, но не влияет на активацию РШР4аР2.
Возможная кооперация р и ТОРрсигнальных путей в регуляции транскрипции
Заключение.
ВЫВОДЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Факторы этого семейства участвуют в поддержании морфологических и дифференцировочных свойств, а также в контроле пролиферации и апоптоза как в печени, так и в других эпителиальных тканях i, . Роль в канцерогенезе двойственна. был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что на некоторые виды опухолей он может оказывай супрессирующее действие , . Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что действие цитокинов на опухолевые клетки зависит от стадии канцерогенеза и особенностей исходной ткани, из которой произошла опухоль i , . v . Целью настоящей работы являлось исследование механизмов регуляции транскрипции центрального фактора гепатоцитарной дифференцировки НМР4а при гепатоканцерогенезе и проверка предположения об участии факторов р и ТЧЗРр в этом процессе. В ходе работы планировалось выяснить возможное место компонентов общих сигнальных путей р и 3 Рр в регуляции системы гканеспецифической экспрессии генов печени. Анализ спектра экспрессии геиатосиецифических транскрипционных факторов в печени мышей, нокаутных по гену р. Создание линии клеток ИсрС2 с инактивированным р и анализ ассоциированного с этим изменения спектра экспрессии гепатоспецифических генов, определяющих уровень дифференцировки клеток. Исследование механизмов дифференциальной регуляции альтернативных промоторов гена НМУ4а при подавлении экспрессии гена р и индукции ТОР3зависимого сигнального пути в клетках гспатомы человека НсрС2. ШР4а на этой модели. НОТ4а. Многочисленные исследования показывают, что прогрессия гспатокарципом может быть связана с нарушением функций геиатоцигарных транскрипционных факторов. Одним из важнейших ГЯФ является ГЮТ4а, который рассматривается как ключевой регулятор гепатоцитарной дифференцировки. В нашей лаборатории было показано, что подавление экспрессии НКР4а является частым событием при прогрессии гспатокарципом, а его экзогенная экспрессия в клетках дедифференцированной гепатокарциномы мыши вызывает реверсию злокачественного фенотипа. Кроме того, активация экспрессии эмбриональных изоформ 1ТКР4ссР2 в печени может свидетельствовать о ранних этапах опухолевой трансформации. За последнее десятилетие накоплено большое количество данных о механизмах взаимной регуляции между гепатоцитарными ядерными факторами. Однако до сих пор остается актуальным вопрос о взаимодействии сети ГЯФ с общими сигнальными каскадами. Существуют указания на то, что именно 1ЮТ4а может выступать в качестве связующего звена между сетью тканеспецифических регуляторов транскрипции и общими клеточными сигнальными путями. Частным случаем этой проблемы является вопрос о механизмах подавления активности Н4а в канцерогенезе, которое происходит в результате нарушения внутриклеточных каскадов сигнальных реакций. Таким образом, исследование возможных механизмов регуляции экспрессии НМР4а представляет не только теоретическое, но практическое значение. НМР4а может изменяться при инактивации опухолевого супрессора р. Ранее были опубликованы данные о том, что в печени нокаутных но гену р мышей может происходить накопление нсдоднфференцироваиных клстокпредшсствен ников гепатоцитов. В ходе нашего исследования мы выяснили, что инактивация р повышает уровень экспрессии эмбриональных изоформ 1МР4а в печени взрослой мыши и в культуре клеток гепатомы человека. Мы продемонстрировали, что подавление функции р в клетках гепатомы человека приводит к активации альтернативного промотора Р2 гена НИЬЧа. Мы показали, что при активации ТОРрсигналыюго пути в культуре гепатомы человека происходит переключение экспрессии изоформ НМР4сс со взрослых на эмбриональные, свидетельствующее о снижении уровня дифференцировки. Кроме этого мы выяснили, что этот процесс связан с индукцией одного из важнейших клеточных сигнальных путей МАР киназного каскада. Выявление механизмов регуляции экспрессии гена Аа представляется важным для разработки новых подходов для терапии опухолей печени, а также для понимания фундаментальных основ процесса дифференцировки в ходе эмбрионального развития животных и человека.