Структурно-функциональный анализ CNG-специфического метилирования ДНК эукариот

• Автор: Шевчук, Тарас Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 136 с.

1. Распределение 5метилцитозина в различных нуклеотидных последовательностях и областях генома высших эукариот.

1.1. Метилируемые последовательности эукариотических ДНК

1.2. СрСостровки и их свойства.

2. Структурнофункциональные свойства цитозинС5ДНКметилтрансфераз

2.1. Функциональная топография первичной структуры прокариотических цитозинС5ДНКметилтрансфераз

2.2. Эукариотические ДНКметилазы

2.2.1. ДНКмегилазы млекопитающих

2.2.2. ДНКметилазы растений.

2.3. Регуляция экспрессии ДНКметилазных генов.

3. Функциональная роль специфических типов метилирования ДНК эукариот.

3.1. Первичная функция метилирования ДНК защита от внутригеномных паразитов

3.2. Срвтип метилирования ДНК.
3.2.1. Метилирование и транскрипция генов. Белки, связывающиеся с метилированной ДНК.
3.2.2. Метилирование ДНК, структура хроматина и деацетилирование
гис гонов
3.2.3. Метилирование ДНК и геномный импринтинг.
3.2.4. Метилирование ДНК и канцерогенез
3.2.4.1. Гипометилирование ДНК.
3.2.4.2. Увеличение ДНКметилтрансфсразной активности в опухолевых клетах.
3.2.4.3. Локальное гиперметилирование генома.
3.3. Несимметричный тип метилирования ДНК.
3.3.1. Метилирование ДНК и е репликация
3.3.2. Метилирование ДНК и выключение генетической экспрессии
3.3.2.1. Животные.
3.3.2.2. Растения. Метилирование трансгенов.
3.3.2.3. Грибы
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Материалы и оборудование
Реактивы, среды и ферментыы.
Методы.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Разработка метода определения уровня метилирования цитозина в ДНК в последовательностях ССТОО
3.2. Влияние гена ДНКметилтрансферазы .II на фенотип трансгенных опухолевых линий собапа 1аЬасиш и уровень метилирования последовательностей СрЫрв в их геноме.
3.2.1. Интеграция гена ДНКметилазы ЕсоЯИ в ГДНК агробактериальной Т1плазмиды дикого типа.
3.2.2. Получение трансгенных опухолевых линий Ыюобапа 1аЬасит, содержащих ген ДНКметилазы Есо1Ш.
3.2.3. Физиологобиохимическая характеристика трансгенных опухолевых линий Мсойапа аЬасиш.
3.2.4. Уровень метилирования последовательностей СрКрО в геноме
трансгенных опухолевых линий ТИсойапа ТаЬасит.
3.3. Метилирование гена кальцитонина человека при лейкозах
3.3.1. Анализ последовательностей ССвв
3.3.2. Анализ последовательностей ССУОО
IV. ВЫВОДЫ.
V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ак аминокислота
БАГ1 бензиламинопурин
кД килодальтон
КЧ ген кальцитонина человека
МГЭ мобильный генетический элемент
МДС миелодиспластический синдром
НУК нафти л уксусная кислота
I острый миелоидный лейкоз
ПААТ полиакриламидный гель
пн пара нуклеотидов
ПЦР полимеразная ценная реакция
тпн тысяча пар нуклеотидов
XI хронический миелоидный лейкоз
Арг устойчивость к ампициллину
Ктг устойчивость к канамицину
устойчивость к налидиксовой кислоте
устойчивость к сулфаниламиду
Тсг устойчивость к тетрациклину
гистоновая ацетилтрансфераза
гистоновая деацетилаза
i очень мелкие I фрагменты 5 5метилцитозин
М ДНКметилтрансфераза ДНКметилаза
ii i домен белок, связывающийся с метилированной ДНК МеСР белок, связывающийся с метилированной ДНК I i i ii предмейотически индуцированное метилирование среда среда МурасигаСкута
любой нуклеозид
ii i сигнал ядерной локализации ii ii посттранскрипционное замолкание генов ресфикционная эндонуклеаза
I i i i точечная мутация, индуцированная повторами аденозилгомоцистеин аденозилметионин
ii ii транскрипционное замолкание генов ii i вариабельный домен, ответственный за узнавание ДНКметилтрансферазой специфической последовательности ДНК А или Т
префикс бдезокси в формулах олигонуклеотидов для краткости опущен
ВВЕДЕНИЕ


Анализ ДНК с помощью таких методов показал, что в ДНК различных животных и растений основное количество шС сосредоточено в динуклеотиде 5 ii, iii, i , i , i . Интересно отмстить, что уже первые результаты анализа метилирования эукариотических ДНК с помощью этих методов указывали на присутствие в ДНК животных и растений ш5С в последовательностях, отличающихся от . Так, в ДНК животных ш5С обнаружен в последовательностях, не соответствующих типу метилирования , . В ДНК растений лТС был обнаружен наряду с динуклеотидом в динуклеотиде пГСрпТС i , i , . В дальнейшем, с помощью указанных методов, а также метода рестрикционного анализа, основанного на применении чувствительных и нечувствительных к метилированию ДНК рестрикционных эндонуклеаз, у растений был выявлен новый тип метилируемой последовательности 5 любой нутслеозид Кирнос и др. ДНК. ДНК, причм за бортом анализа оставалась подавляющая часть самих последовательностей , а также другие возможные типы метилирования ДНК. На это, кстати, указывали и результаты анализа ДНК с помощью рестриктазы I, свидетельствующие о метилировании внешнего цитозина в последовательностях в ДНК животных i, . Такая специфичность метилирования последовательности могла соответствовать симметричному или несимметричному типу метилирования ДНК. Анализ метилирования ДНК методами геномного секвенирования, основанного на избирательном дезаминировании в ДНК цитозина но не тС в присутствии бисульфита натрия, доказал существование у млекопитающих типа метилирования ДНК . ДНК см. В то время как геном беспозвоночных состоит из компартментов метилированной и не метилированной ДНК i . ДНК, обогащенной динуклеотидами . В геноме животных островки найдены только у позвоночных. Более половины всех генов млекопитающих содержат островки вблизи своих стартовых точек транскрипции i . Таким образом, в этих участках ДНК отсутствует дефицит динуклеотидов , ярко выраженный в суммарных Д1I позвоночных и также наблюдаемый в ДНК растений Мазин, . В ДНК различных тканей островки неметилированы независимо от экспрессии или молчания гена . Исключение представляют молчащие метилированные гены одной из инактивированных Ххромосом i i. При старении в нормальных тканях также наблюдается метилирование островков некоторых генов, в чем усматривается связь между старением и канцерогенезом I . I . Следует отметить, что островки тканеспецифических генов, например гена аглобина человека, поддерживаются неметилированными во всех тканях, даже если они не транскрибируются i . Это метилирование связано с тканеспецифическими генами но не с хаускиппинг генами и с потерей клетками своих специфических функциональных свойств в культуре . Таким образом, существует четкая корреляция между метилированием островков и подавлением транскрипции соответствующих генов. На фоне многочисленных доказательств связи метилирования островков с процессом выключения транскрипции обращает на себя внимание гипотеза П. Джонса, предлагающая уточнить эго общепринятое положение. Согласно этой гипотезе, только метилирование островков в промоторной области генов может блокировать инициацию транскрипции, в то время как метилирование островков, расположенных в кодирующей области гена, не влияет на элонгацию транскрипции , . Примером таких генов могут быть мышиные гены I2 и и гены человека АРОЕ, I4, , рЕх2 , На примере этих генов автор указываег на существование парадоксального положения, когда метилирование транскрибируемой области гена может коррелировать с его экспрессией. П.Джонс объясняет этот парадокс метилирования тем, что транскрипция через островки может индуцировать метилирование v, повышающее е наджность и блокирующее транскрипцию с неподходящих или фальшивых промоторов внутри транскрибируемой области , . Так как наряду с геномом млекопитающих островки характерны для генома высших растений, эта гипотеза может исследоваться также и на растениях. I i . В то же время, метилирование островков приводит к образованию компактной и нечувствительной к нуклеазам структуры хроматина .