Роль остатков аргинина 226, тирозина 72, аспарагиновой кислоты 133 и гистидина 458 в каталитическом механизме триптофаназы из Proteus vulgaris

• Автор: Куликова, Виталия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил

Содержание
ф Введение

I. Обзор литературы. Структура и механизм действия пиридиксаль

фосфатзлвисимых лиаз

1. Классификация и реакционная специфичность пнридоксаль5фосфат

зависимых лиаз

2. Пространственное строение пиридоксаль5фосфатзависимых лиаз

3. Каталитический механизм пиридоксаль5фосфатзависимых лиаз

4. Роль отдельных аминокислотных остатков в механизме пиридоксаль

фосфатзависимых лиаз

II. Результаты и их обсуждение

1. Введение
2. Очистка триптофаназы и спектральные свойства фермента
3. Факторы, определяющие субстратную специфичность триптофаназы
4. Роль остатка аргинина 6 в механизме действия триптофаназы
5. Роль остатка тирозина в механизме действия триптофаназы
6. Роль остатков аспарагиновой кислоты 3 и гистидина 8 в механизме
действия триптофаназы
7. Выводы
III. Методы исследования
1. Выращивание бактериальных масс, выделение и очистка ферментов
2. Определение концентрации белка
3. Определение активности ферментов
4. Определение чистоты выделенных ферментов
5. Кинетические исследования
6. Спектральные исследования ферментов
7. Получение апофермента
8. Определение констагты диссоциации пиридоксаль5фосфата
9. Идентификация продуктов побочной реакции трансаминирования
Список цитированной литературы
Введение


Кристеном и соавторами 3 была предложена классификация на основе гомологии первичных структур профильный анализ первичных последовательностей пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов показал, что большинство этих ферментов можно отнести к одному из трех гомологичных семейств а, р или у. Таблица 1. Пиридоксаль5фосфатзависимые лиазы. Основная катализируемая реакция
ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. Ьтрсонин фосфат

ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. Бконью гатрлиаза КБСН2СНКНзСОО И. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. ЕС 4. Являющееся наиболее многочисленным асемейство включает в себя ферменты, которые катализируют, за несколькими исключениями, превращения аминокислот, в которых ковалентные изменения происходят у Саатома субстрата. Ферменты р и уссмсйств катализируют ковалентные превращения при Р или ууглеродном атоме рзамещение, рэлиминирование или узамещенне, уэлиминирование. Для некоторых ферментов отсутствует корреляция между принадлежностью к тому или иному семейству и реакционной специфичностью, как, например, для тирозин феноллиазы и трнптофаназы, которые являются членами асемсйства, но катализируют реакции Рэлиминирования. Принадлежащая к ассмейству аминоциклопропан1карбоксилатсинтаза катализирует а,уэлиминирование треонинсинтаза рссмейство катализирует реакцию у,рзамещения цистатионинрлиаза усемейство реакцию Рэлиминирования. Кроме того, многие пиридоксаль5фосфатзависимые ферменты катализируют побочные реакции, которые соответствуют основным катализируемым реакциям других пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов. Структурное различие между а и Рсемействами заключается в том, что остаток лизина, связывающий кофермент в активном центре, в ферментах асемейства располагается в области аминокислотных остатков , в то время как в ферментах Рсемейства этот остаток лизина находится в Ыконцевом фрагменте полипептидной цепи в пределах остатков 8. В ферментах усемсйства пиридоксаль5фосфат связан в том же сегменте, что и у представителей асемсйства. Таким образом, на основании гомологии первичных структур ферментов было высказано предположение об эволюционной связи аи усемейств 3. Вбзависнмые ферменты принадлежат к четырем эволюционно независимым гомологичным семействам 6. Это а и Рсемейства, семейства аминотрансферазы Эаминокислот и аланинрацемазы. Семейство является наиболее многочисленным и функционально роазнообразным, оно включает ферменты, катализирующие реакции с участием не только ауглеродного атома субстрата, но и ууглеродного атома, выделенные ранее в отдельное усемейство 3. Три других семейства содержат значительно меньшее количество ферментов, являясь при этом структурно и функционально более гомогенными. Предполагается, что в процессе своего эволюционного развития витамин В 6зависимые ферменты вначале различались по реакционной специфичности, а затем произошло их разделение по субстратной специфичности 6, 7. Функциональная специализация большинства пиридоксалевых ферментов завершилась уже в общей древней клетке, являвшейся предшественником эукариот, эубактерий и архсбактсрий перед их разделением на три биологических царства около ,5 млрд. Столь раннее возникновение в процессе биологической эволюции характерно, вероятно, для большинства пиридоксаль5фосфатзависимых ферментов, так как они катализируюут реакции, связывающие различные метаболические пути, большинство же этих метаболических путей установилось уже в древней клетке, являвшейся предшественником современных клеток 9. Пространственное строение пиридоксаль5фосфатзависимых лиаз. Для полного описания молекулярного механизма действия того или иного фермента требуется точное знание химической топографии активного центра в свободном ферменте и в образуемых им промежуточных комплексах с субстратами и ингибиторами. Наиболее полную и точную информацию о структуре активных центров даст рентгенострукгурное исследование кристаллов ферментов, а также их комплексов с аналогами субстратов.