Изучение структуры и стабильности белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вирионов

• Автор: Немых, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура потексвирусов

1.1. Общая характеристика потексвирусов

1.2. Структура вирионов потексвирусов

1.2.1. Изучение структуры ХВК и других потексвирусов методом

дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии

1.2.2. Изучение структуры ХВК оптическими методами

2. Структура и свойства белков оболочки потексвирусов

2.1. Первичная структура белка оболочки ХВК и посттрансляционные модификации
2.2. Прогеолиз и аномальная электрофоретическая подвижность БО ХВК
2.3. Антигенные свойства ХВК и БО ХВК
2.4. Гидродинамические свойства БО ХВК
2.5. Оптические характеристики изолированного БО ХК
2.6. Трехмерная модель БО ХВК в составе вириона
3. Реконструкции ХВК и ВМП
4. Ремоделированне вирнонов ХВК
4.1. Ремоделирование вирионов ХВК под действием ТБ1 белка
4.2. Фосфолирирование БО ХВК и котрансляционная разборка
4.3. Роль Мконцсвого пептида в активации трансляции вирусной РНК
4.4. Механизм ближнего транспорта ХВКинфекции
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
2. Накопление и выделение вирионов ХВК
3. Накопление и выделение вирионов ВТМ
4. Выделение белка оболочки ХВК
5. Выделение белка оболочки ВТМ
6. Электрофорез в ПААГ в прнсугствии БЭБ
7. УФспсктроскопия
8. Определение истинного поглощения светорассеивающих систем методом
экстраполяции
9. Турбидиметрия
. Флуоресцентная спектроскопия
. Спектроскопия кругового дихроизма
. Аналитическое ультрацентрифугирование
. Динамическое лазерное светорассеяние
. Дифференциальная сканирующая калориметрия
. Изотермическая титрующая калориметрия
. Инкубация вирионов ХВК С
. Математические расчты
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Действие нагревания на структуру и стабильность изолированного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов
1.1. Определение температуры денатурации БО ХВК в свободном состоянии и в составе вириона методом ДСК
1.2. Термоиндуцированная агрегация ХВК и его белка оболочки
1.3. Влияние нагревания на БО ХВК
1.4. Влияние нагревания на вирионы ХВК
2. Действие ионных детергентов на структуру и стабильность свободного БО ХВК н БО ХВК в составе вирионов
2.1. Анионный детергент ДСН
2.1.1. Действие ДСН на БО ХВК
2.1.2. Действие ДСН на вириоиы ХВК
2.2. Катионный детергент ЦТАБ
2.2.1. Действие ЦТАБ на БО ХВК
2.2.2. Действие ЦТАБ вирионы ХВК
2.2.3. Действие ЦТАБ вирионы ВТМ
2.3. Определение стехиометрии и энергетики процесса взаимодействия ВО ХВК с детергентами методом изотермической титрующей калориметрии
2.4. Определение константы седиментации нативного БО ХВК и БО ХВК,
подвергшегося действию наревания и детергентов
3. Сравнительное исследование препаратов БО ХВК, выделенных солевым н ацетатным методами
4. Дестабилизация частиц ХВК при С
4.1. Разрушение вирионов ХВК при С низкими концентрациями ЛС1
4.1.1. Действие инкубации при С на вирионы ХВК
4.1.2. Свойства ВО ХВК освобождающегося из вирионов действием Ь1С
при С
4.1.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия интактных
препаратов ХВК и препаратов, инкубированных при С в присутствии
4.1.4. Инкубация ВТМ при С в присутствии и в отсутствии 1лС1 Ю
4.2. Действие и С на вирионы ХВК
4.3. Разрушение вирионов ХВК при С низкими концентрациями СаСЬ Ю
4.4. Разрушение вирионов ХВК при С ДСН Ю
4.5. Действие высоких концентраций 1ЛС1, СаСЬ и С1 на изолированные
БО ХВК и БО ВТМ
5. Модифицированная модель структуры БО ХВК в составе вириона
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Сравнение стабильности свободного БО ХВК и БО в составе вирионов но отношению к нагреванию и действию детергентов
2. Возможный механизм дестабилизации вирионов ХВК при С
3. Новый вариант трехмерной модели БО ХВК как объяснение структурных
перестроек
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В силу целого ряда причин именно потексвирусы на сегодня представляются оптимальным объектом для различных нанотехнологических разработок, таких как накопление и презентация антигенных пептидов и белков на поверхности вирионов. Или просто для относительно легкого и быстрого получения самых разных посторонних белков в зараженных или трансформированных растениях. Потексвирусы одна из самых известных групп спиральных вирусов растений. Изучение этой группы вирусов продолжается уже более полувека. Данная глава литературного обзора будет включать в себя как общую характеристику потсксвирусов, так и более подробное описание отличительных особенностей отдельных представителей этой группы. Род потсксвирусов xvi является одним из восьми родов, принадлежащих к семейству гибких спиральных вирусов растений xivii . Несмотря на продолжительную историю изучения иотексвирусов, информация об их структуре остается весьма ограниченной. Для вирионов потсксвирусов известны только длина и диаметр частиц, шаг спирали, число субъединиц белка оболочки БО па виток спирали и число нуклеотидов на субъединицу БО. Вирионы потсксвирусов представляют собой гибкие нитевидные частицы рис. Длина вирусных частиц составляет нм i . Шаг спирали варьирует от 3,3 до 3,6 им. Считалось установленным, что количество субъединиц БО на один виток спирали у всех иотексвирусов примерно одинаково i . В этой работе авторами были проанализированы 8 представителей группы потсксвирусов и сделан вывод о том, что число субъединиц БО близко, но немного меньше 9. Потексвирусы содержат около 6 РНК и БО. Молекулярный вес вирусных РНК составляет от 2,1 х 6 до 2,4 х 6 кД. Вирусная РНК располагается на расстоянии 3,,6 нм от оси вириона , . Считалось, что частицы потсксвирусов имеют центральный канал, радиус которого составляет примерно 1,5 нм i i, . На рисунке 2 представлено схематическое изображение структуры вириона одного из потексвирусов. Поверхность вирусных частиц имеет желобки, наличие которых приводит к агрегации бок о бок вирусных частиц в сухом состоянии i i, . Потексвирусы кодируют в своем геноме не один транспортный белок ТБ, как вирус табачной мозаики ВТМ, а транспортный модуль, состоящий из тройного кластера перекрывающихся генов i тройного блока генов ТБГ и относятся к супергруппе альфавирусов растений v , vv, . Рис. Частицы Хвируса картофеля ХВК под электронным микроскопом. Длина вириона 5 нм, диаметр нм, шаг спирали 3,5 нм. Рисунок взят из работы V . Рис. Схематическое изображение структуры частицы вируса мозаики нарциссов ВМН. Показано наличие центрального канала диаметром 1,5 нм, РНК располагается на расстоянии 3,3 нм от оси вириона. Рисунок взят из работы i i, . Зконце полиЛ последовательность i , v . РНК, а для экспрессии 5дистальных генов субгеномиые РНК. РНКзависимую РНКполимсразу, хсликазу и метилгуанилилтрансфсразу i , . Однонитевая молекула плюс РНК потексвирусов кодирует пя ть открытых рамок трансляции ОРТ. ОРТ1 располагается за 5иетранслируемой областью и транслируется с геномной РНК с образованием кД белка, содержащего три репликативных домена метилгуанилилтраисферазу, хеликазу суперсемейства 1 и РНКзависимую полимеразу супергруппы 3 v . ОРТЗ и 4 представляют собой тройной блок генов, кодирующий ТБ v . Д, кД и кД, соответственно. ОРТ5 кодирует белок оболочки БО . ТБГ был впервые идентифицирован как консервативный генетическим элемент при сравнительном анализе РНКгсномов вирусов растений, принадлежащих к разным таксономическим группам v . С помощью мутаций, выключающих экспрессию генов тройного блока, было обнаружено, что все кодируемые им белки необходимы для транспорта вирусов растений . В состав белка ТБГ1 молекулярная масса кД типичного представителя группы потексвирусов Хвируса картофеля ХВК входит два функциональных домена концевой, включающий IIV консервативные мотивы и отвечающий за локализацию ТБГ1 в специфическом компартменге клетки, и Сконцевой с V и VI консервативными мотивами, отвечающий за обеспечение транспортной функции v . ТБГ1 белки потексвирусов обладают РНКсвязывающей активностью. На основании многих экспериментальных данных но изучению РНКсвязывающей активности ТБГ1 потексвирусов можно сделать вывод о неспецифическом взаимодействии РНК и белка.