Комплементарно адресованное алкилирование нуклеиновых кислот в клетках асцитной карциномы КРЕБС-2

• Автор: Райт, Антонина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 138 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Использованные сокращения.

Введение

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Комплементарно адресованная модификация, перспективы биологических приложений подхода .
1.2. Конструкции и основные свойства реагентов для комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот . ю

1.2.1. Реакционноспособные терминальные производные олиго и полинуклеотидов .

1.2.2. Полимодифицирующие реагенты .

1.3. Комплементарно адресованное алкилирование 2, 4м2хлорэтилкметиламинобензилиденолигонуклеотидами

1.3 Л. Комплементация 2,3 и2хлорэ гилГ

метиламинобензилиденолигонуклеотидов .

1.3.2. Механизмы алкилирования в комплементарных комплексах.
1.4. Влияние олигонуклеотидов на биохимические и биологические процессы в культурах живых клеток.
Глава 2. Результаты и обсуждение результатов . .
2Л. Обоснование методов анализа и фракционирования биополимеров клеток асцитной карциномы Кребс2.
2.2. Сорбция бензилиденовых производных олигонуклеотидов клетками асцитной карциномы Кребс2.
2.3. Алкилирование биополимеров в клетках асцитной карциномы Кребс2 Спроизводными нонатимидилилуридина .
2.4. Анализ специфичности внутриклеточного ал
килироаания нуклеиновых кислот.
2.5. Химическая направленность внутриклеточного
алкилирования нуклеиновых кислот.
2.6. Сохранность адреса реагентов, ковалентно
связанных комплементарными нуклеиновыми кислотами в клетках асцитной карциномы Кребс
2.7. Кинетика и механизм внутриклеточного алкилирования
2.8. Жизнеспособность клеток асцитной карциномы Кребс2, экспонированных с реагентами . . . .
Глава 3. Экспериментальная часть.
3.1. Вспомогательные материалы и методики . .
3.2. Реагенты и их оксианалоги.
3.3. Культура клеток
3.4. Выделение ядер.
3.5. Исследования сорбции реагентов и их окси
аналогов.Ю
3.6. Исследование алкилирования биополимеров в
3.7. Выделение суммарной РНК клеток.
3.8. Выделение ДНК клеток .Ю
3.9. Выделение ро1уАтрактов мРНК
ЗЛО. Микроколоночная гельхроматография ро1ул
3 Идентификация алкилированных в клетках оснований нуклеиновых КИСЛОТ
ЗЛ2. Определение цитотоксичности реагентов и их
оксианалогов .Ю
Выводы
Цитированная литература.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АКК асцитная карцинома Кребс2.
БДИ1 6бром5,5диметоксигексаногидразид.
ДФХФ хлорангидрид дифенилфосфорной кислоты.
ТФП Ц,н,трибхлорэтилМанрормилфенилпропилендиамин1,3.
оснцс 4н2хлорэтилнметиламинобензальдегид. С1нснреагенты 2,зи2хлорэтилЦметиламинобензилиденолиго и полинуклеотиды.
I с6нга2ратрт4гистс1.
IX 1 ТрЕ1 дгЦСННС1.
ш атрдгиснйС1.
IV рратрдгисннс1.
V аТСССАААСгАСНИС.
стсннреагенты 4 ы2хлорэтилЦметиламино бензил5 фосфамиды олигонуклеотидов.
МвСОС1 хлорангидрид мезитилешсарбоновой кислоты. РЬдРРуЗ2 эквимольная смесь трифенилфосфина и 2,2дипиридилдисульфида.
ЗМуг цметклп4формилфениламино этил цитозин, илае, исиа, нсуа аналогичные зн алкиларильные производные аденина, гуанина и цитидин2зфосфата.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Реализация этого принципа осуществлена на целом ряде объектов тРНК, рРНК, денатурированных ДНК и их фрагментах в простых системах i vi с применением олиго и полинуклеотидов с терминально присоединенными остатками ароматических 2хлорэтиламинов см. Высокие эффективность и селективность комплементарно адресованной модификации алкилирования позволили включить в круг практических выходов метода химическое фрагментирование нуклеиновых кислот, маркирование и изучение их функционально значимых участков, ограничение действия ферментов и др. Кроме того, достижения подхода стимулировали поиск его новых приложений, а также работы по синтезу комплементарно адресованных реагентов разнообразных конструкций. Так, например, недавно осуществлена i vi направленная модификация ДНК фага Т7 полиалкилирувдими РНК транскриптами генов фага 7, 8. К настоящему времени созданы достаточные основания для биологических приложений комплементарно адресованных реагентов на основе олигонуклеотидов 9, . Разработаны и применяются эффективные и, в тем числе, автоматизированные методы препаративного получения олигодезоксирибонуклеотидов и их неионных триэфирных производных II. Дополнительные и
альтернативные возможности увеличения масштабов производства олигодезоксирибонуклеотидов желаемой первичной структуры предоставляются техникой клонирования плазмид . Прогресс в области синтеза реакционноспособных производных олиго и полинуклеотидов также существенен . Как следствие, уже сейчас обсуждаются такие, ориентированные на применение комплементарно адресованных реагентов, программы, как направленный мутагенез i viv, лечение вирусных заболеваний, подавление вирусного онкогенеза внутриклеточным блокированием генетического материала вирусов и др. Ясно, однако, что обращение к столь сложно организованным функционирующим системам, какими являются многоклеточные организмы, было бы преждевременным в отсутствии доказательств комплементарно адресованного характера внутриклеточной модификации нуклеиновых кислот и исследований ее специфики на более простых биологических объектах эукариотических клетках, живущих вне организма. Имвнно в этом направлении и выполнена предотавляемая работа. Конструкции и основные свойства реагентов для комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот. Успех исследования, основанного на комплементарно адресованной модификации, во многом предопределяется конструированием реагентов , либо их выбором из числа уже апробированных. Современный ассортимент реагентов, как нашедших применение, так и потенциально применимых в комплементарно адресованной модификации, достаточно разнообразен 6, и предоставляет определенные возможности выбора с учетом специфики исследования. Внутри ассортимента удобно подразделе
ние на терминальные содержащие не более двух модифицирующих группировок и внутрицепные обычно с большим числом группировок производные олиго и полинуклеотидов 6. Последние в дальнейшем будут называться полимодифицирующими а при наличии алкилирущих группировок полиалкилирувдими реагентами . Реакционноспособные терминальные производные олиго и полинуклеотидов. В соответствии с принципами, изложенными в развернутом виде в работе 3, терминальные производные для комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот обычно получают, присоединяя модифицирующие группировки к концевым гидроксильным или фосфомоноэфирным группам олиго и полинуклеотидов. Допускается 3, что при такой конструкции реагента все гетероциклические основания его адреса могут участвовать в комплексообразовании. Для того, чтобы реагенты максимально эффективно реагировали именно в комплементарных комплексах, признано целесообразным,чтобы модифицирующая группировка обладала средней реакционной способностью и была не особенно избирательной. Кроме названных положений при конструировании реагентов учитывают также, что образование связи между адресующей и модифицирующей группировками должно осуществляться методами получения производных без предварительной защиты других функциональных групп исходных олиго и полинуклеотидов. Связь, образующая реагент, должна быть, естественно, устойчивой в условиях комплексообразования и, предпочтительно, селективно расщепляемой за пределами этих условий 3.