Характеристика продуктов генов кластера утилизации ламинарина Thermotoga neapolitana

• Автор: Волков, Илья Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода ТПегтоЬода и их гликозилгидролазный комплекс ферментов.

1.2. Структура кластера утилизации ламинарина бактерии пеароЫ1апа.

1.3. 31. 3глюканы, 31,31,4глюканы и их распространенность в природе

1.4. 31,3 и 01.3 1,4глюканазы, рглюкозидазы, их биохимические и субстратные характеристики
1.5. Систематика гликозилгидролаз на основе гомологии аминокислотных последовательностей
1.6. Основные механизмы каталитического действия и характерные особенности пространственного строения гликозилгидролаз.

1.7. Доменная структура некоторых рглюканаз и рглюкозидаз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.2. Химические реактивы и субстраты
2.3. ПААГэлектрофорез белков и методы получения зимограмм.
2.4. Изоэлектрофокусирование и определение р1
2.5. Определение концентрации белка
2.6. Методы определения восстанавливающих сахаров й глюкозы
2.7. Методы определения ферментативной активности
рглюканаз и рглюкозидаз.
2.8. Определение термостабилькости ферментов.
2.9. Анализ продуктов гидролиза лихенана и ламинарина
2 Изучение адсорбции на нерастворимых субстратах.
2 Определение константы Михаэлиса
2 Изучение ретардации ЬашА при прохождении денатурирующего гельэлектрофореза в ПААГ в присутствии растворимых субстратов
2 Ультрафильтрация.
2 Определение локализации ферментов в Е.со.
2 Разрушение клеток ультразвуком.
2 Очистка рекомбинантных ферментов
21. Очистка рглюкозидазы В1В
22. Очистка 01, 3глюканазы ЬашА.
23. Очистка делеционных производных ЬашА.
2 Анализ аминокислотной последовательности ЬашА.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Анализ аминокислотной последовательности ВВ
3.2. Очистка .
3.3. Характеристики В1В
3.4. Анализ доменной структуры ЬашА и функций доменов.
3.5. Очистка ЬашА.
3.6. Строение делеционных производных ЬашА
3.7. Очистка делеционных производных ЬашА
3.8. Свойства ЬашА и ее делеционных производных.
3.9. Адсорбционные свойства делеционных производных ЬашА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Изучение проблемы тепловой денатурации и механизмов термостабильности белковых молекул должно привести к значительному прогрессу в белковой инженерии и созданию биотехнологически совершенных ферментов. В свою очередь, понимание механизмов термостабильности белков тесно связано с пониманием принципов сворачивания фолдинга полипептидной цепи, а также сил, стабилизирующих белковые молекулы при высокой температуре. Другим важным направлением современных исследований является изучение феномена мультидоменности некоторых гликозилгидролаз. Изучение функциональных свойств различных классов доменов, принципов их организации и междоменных взаимодействий позволит конструировать мультидоменные белки с широким спектром заданных свойств. ЬатА и Е1В могут быть совместно использованы для переработки ламинарина, являющегося основным углеводным компонентом некоторых бурых водорослей, до глюкозы. ЬатА может найти применение в научных исследованиях для получения протопластов грибов и дрожжей, а также для гидролиза 313,14глюканов в пивоварении. Целью настоящей работы было исследование функций и структуры термостабильных ферментоз ламинариназы ЬатА и рглкжозидазы , участвующих в гидролизе ламинарина. ЬатА, а также ее делеционных производных. . и функциональных свойств ее доменов. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Бактерии рода и их глюканогидролазный комплекс. анаэробная грамотрицательная спорообразующая экстремальнотермофильная эубактерия, растущая при температурах С с оптимумом около С. Культуры этих бактерий были выделены из геотермальных источников морского дна . По результатам секвенирования рРНК она ближе всего к эубактериям, хотя близкого родства ни с одной из известных групп не было найдено. В целом рост бактерии наблюдался в диапазоне от 5. 6. Подобный диапазон концентрации солей составляет от 0. ii способна утилизировать глюкозу, рибозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, гликоген, дрожжевой экстракт, а также цельный . Основными продуктами ферментации были С, Н2. лактат и уксусная кта . Целлюлазы и ксиланазы присутствуют в культуральной жидкости з виде отдельных ферментов без образования комплексов типа целлюлосом ii , i , i i и других . ксилозидаз, рглюкозидаз, глюкуронидазы, арабинозидазы и аамилазы , 4, 8, . Структура кластера утилизации ламинарина термофильной анаэробной бактерии i. Ранее в Лаборатории молекулярной генетики анаэробов ИМГ РАН был получен клон с плазмидой рТТ v,, содержащей ген I. Р1,3глюканазу. На 5конце обнаружена открытая рамка считывания, транслированная аминокислотная последовательность которой оказалась гомологичной последовательностям рглюкозидаз семейства 3. Была создана плазмида РТТ, содержащая полный ген рглюкозидазы . Гены и 1апг4 расположены рядом на последовательности ДНК Т. Рис. Расположение генов I и на хромосоме i. Между и ЬатА не обнаружено последовательностей, близких к каноническим последовательностям бактериального промотора. При этом палиндромная структура, соответствующая типичному терминатору транскрипции, присутствует за 3концом ЬашА отмечен прямоугольником с подписью Тег, но не найдена ни между и ЬатА, ни между геном кодирующим АТФсвязывающий белок и 1шп4 . Случаи кластерной организации генов глюканогидролаз, выполняющих близкие функции, достаточно распространены. Гены ксиланазы и i iix расположены рядом на последовательности ДНК . Относительно низкомолекулярный средняя степень полимеризации около полисахарид ламинарии компонент морских макроводорослей семейства ii отдел i бурые водоросли . Этот полисахарид присущ также и другим бурым водорослям , i, i, ii . В этих полисахаридах остатки глюкозы связаны Р1,6связей. Подобные полисахариды продуцируются также некоторыми бактериями курдлан из i 9. Кроме того, , iii, . К числу нерастворимых и .