Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот

• Автор: Коробов, Владислав Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурнофункциональные особенности организации плазмид биодеградации

1.1. Плазмиды биодеградации бактерий

1.2. Особенности организации катаболической плазмиды рР4 i еШгорИия ЛИР

1.2.1. Особенности организации производных плазмиды р1Р

1.3. Другие плазмиды биодеградации ксенобиотиков

1.4. Трансмиссивные свойства плазмид биодеградации

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Идентификация штаммов

2.2.1. Идентификация штаммов по признакам морфологической, морфометрической, физиологической и биохимической дифференциации
2.2.2. Классификация бактерий по последовательности генов Б рРНК
2.3. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет
2.4. Определение количества хлорфеноксиуксусных кислот в культуральной жидкости
2.5. Идентификация продуктов метаболизма 2,4,5Т
2.6. Выделение внехромосомных элементов геномов бактерий
2.7. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле
2.8. Элиминация плазмид из клеток бактерий, индуцированная бромистым этидием
2.9. Фракционирование препаратов плазмидной ДНК методом гельфильтрации
2 Обработка препаратов плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2 Определение размеров фрагментов ДНК
2 Иммобилизация препаратов ДНК на мембранном фильтре
2 Получение препарата радиоактивной ДНК
2 Гибридизация препаратов ДНК на фильтре
2 Физикохимические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот 4ХФУК, 2,4Д, 2,4,5Т
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Морфологические, морфометрические, физиологические и биохимические признаки штаммов I 4, I, I и I
3.2. Филогенетическое положение штаммов I 4СРА, I, I и I2 по данным секвенирования генов рРНК
3.3. Динамика деградации хлорфеноксиуксусных кислот i i I 4СРА, i I и i I в периодической культуре
3.4. Идентификация и структурнофункциональный анализ плазмид штаммов i i I 4СРА, i I и i I
3.4.1. Получение сфсропластов и выделение плазмид
3.4.2. Рестрикционное картирование плазмид рСНЗб 4СРА, и
3.4.3. Локализация генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, и
3.5. Анализ процессов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов i i I 4СРА, i I2I и i I
3.6. Сравнительный анализ генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов i i I 4СРА, i I и i I с плазмидой 4 штамма i
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В настоящее время плазмиды представляют большую ценность как материал для исследований молекулярной структуры и механизмов функционирования геномов современных прокариот. Они обладают несколькими достоинствами. Плазмиды имеют относительно небольшие размеры, а это означает, что манипулировать с ними i vi гораздо проще, чем с хромосомами. Кроме того, обычно клеткихозяева плазмид могут существовать и размножаться без них, поэтому можно выявить те свойства, которые плазмиды сообщают клетке. Поскольку такие, детерминируемые плазмидой функции, нередко могут быть использованы для скрининга, плазмиды делают возможным проведение многих молекулярногенетических экспериментов. В этом контексте плазмиды биодеградации, или плазмиды, представляют собой прекрасную модель для изучения вопросов строения, функционирования и эволюции генов, вовлеченных в реакции живых систем на условия окружающей среды, а именно, на действие ксенобиотиков. Очевидным является то, что результаты таких исследований имеют не только фундаментальное, но и большое практическое значение, так как плазмиды и несущие их клетки можно использовать для создания штаммовдеструкторов нового поколения. Вместе с тем следует отметить, что к настоящему моменту известно всего лишь несколько видов бактерийдеструкторов, у которых полностью или частично описаны свойства внехромосомных элементов, контролирующих деградацию хлорированных ароматических соединений. Во многом закономерности их организации и функционирования остаются неизвестными. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы выявить молекулярногенетические особенности организации новых плазмид штаммовдеструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства. Новизна исследований. Впервые показано, что штаммыдеструкторы i i I 4СРА, i I и i I обладают плазмидами указанные плазмиды получили следующие обозначениярСН 4СРА, и . Построены рестрикционные карты плазмид рСНЗб 4СРА, , и определены их размеры длина плазмид составляет 5,4 т. Показано, что на плазмиде рСНЗб 4СРА и плазмиде расположены гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот. В соответствии с этим плазмиды рСНЗб 4СРА и были классифицированы как новые плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот штамма i I расположены вне плазмиды . Выявлено, что плазмиды рСНЗб 4СРА и имеют существенные отличия от плазмиды 4 i 4. Установлено, что катаболизм 2,4,5Т штаммов i i I 4СРА, i I и i I происходит с образованием метилированных форм хлорфеноксиуксусных кислот и 2гидрокси2гексендионовой кислоты. Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования расширяют представления об особенностях организации молекулярногенетических систем, контролирующих процессы конверсии ксенобиотиков в клетках прокариот. Полученные данные могут быть применены для создания новых штаммовдеструкторов с заданными свойствами, а также в разработках ресурсосберегающих технологий восстановления окружающей среды в сфере предприятий нефтехимического профиля. Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы УШго Экологического конгресса Корея, , Первого конгресса европейских микробиологов Словения, , Х1Хго Международного генетического конгресса Австралия, , конференции ЕЬБО Франция, , 1го Международного конгресса Биотехнология состояние и перспективы развития Москва, , 1го съезда биохимического общества С. Петербург, , Международной конференции Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий Оренбург, , Международной конференции Поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина Пущино, , 4го Международного семинарапрезентации Биотехнология Пущино, , 2го Международного Семинарашколы Массспектрометрия в химической физике, биофизике и экологии Москва, , Всероссийской конференции Научные аспекты экологических проблем России Москва, , 2й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.