Выделение и свойства рибонуклеиновых кислот кодируемых аденовирусным геномом и анализ продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов

• Автор: Чайка, Олег Вадимович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения

ВВЕДЕНИЕ А

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Геном аденовирусов и его экспрессия .

1.1.1. Строение генома аденовирусов .

1.1.2. Экспрессия генома аденовирусов Ю

1.1.2.1. Ранняя фаза инфекционного цикла

1.1.2.2. Поздняя фаза инфекционного цикла

1.1.3. Информационные РНК мРНК аденовирусов. .

1.2. Структурные белки аденовирусов

1.2.1. Физикохимические свойства .
1.2.2. Иммунологические свойства
1.3. Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных системах
1.3.1. Особенности мРНК эукариот
1.3.2. Системы бесклеточной трансляции АЗ
1.3.3. Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов А
1.3.А. Трансляция мРНК аденовирусов в системах
йг Усьо.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 5А
2.1. Материалы 5А
2.2. Методы исследования .
2.2.1. Получение бесклеточной системы из лизата ретикулоцитов
2.2.2. Выделение РНК вируса табачной мозаики . .
2.2.3. Выделение поздних мРНК аденовирусов .
2.2.А. Выделение полиАсодержащей фракции мРНК
2.2.5. Выделение глобиновой мРНК
2.2.6. Получение С и 5меченых сп пго белков аденовирусов .
2.2.7. Трансляция РНК в бесклеточной системе . .
2.2.8. Обработка проб после трансляции .
2.2.9. Дискэлектрофорез белков в полиакриламидном геле
2.2 Авторадиография
2.2 Очистка антигексоновых антител с помощью иммуноаффинной хроматографии .
2.2 Удаление примеси антител против гексона из препарата антиотростковой сыворотки. .
2.2 Радиоиммунопреципитационный анализ. . . .
2.2.I. Олигопептидный анализ гексонов аденовирусов
2.2 Электрофорез мРНК в полиакриламидном геле
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ . .
3.1. Выделение поздних мРНК аденовирусов и их физикохимическая характеристика . .
3.1.1. Получение препаратов РНК из клеток, заракенных аденовирусами . .
3.1.2. Электронномикроскопический и электрофоретический анализ мРНК .
3.2. Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов . . .
3.2.1. Оптимизация бесклеточной системы из ретикулоцитов
3.2.2. Трансляционная активность мРНК 7 и i
3.3. Характеристика продуктов трансляции бесклеточной системы из ретикулоцитов
3.3.1. Электрофоретический анализ продуктов трансляции .
3.3.2. Олигопептидное картирование гексонов аденовирусов 7 и
3.3.3. Идентификация продуктов трансляции методом радиоиммунопреципитационного анализа . . .
ГЛАВА А. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЛИТЕРАТУРА


При экстракции ДНК из очищенных вирионов путем обработки проназой и ДСН образуются линейные молекулы ДНК, если ке выделение проводить с помощью гуанидинI с последующим диализом, то, как показано для аденовирусов человека 2 и птиц О 7, молекулы ДНК представлены в этом случае в форме двуспиральных кольцевых структур, которые превращаются в линейные молекулы ДНК после обработки проназой. Так было показано, что в поддеркании циркулярной структуры аденовирусной ДНК принимает участие особый терминальный белок ТБ. Установлено, что ТБ по массе составляет не более 0,45 общей массы белков вириона и имеет мол. Д 5. При помощи фосфодиэфирной связи ТБ ассоциирован с 5концом вирионнйй ДНК . Исследованиями ряда авторов показано, что комплекс ДНКТБ играет ключевую роль в процессе инициации репликации у аденовирусов 4, 6, а такке в предохранении ДНК от воздействия экзонуклеаз 53 . Следует, однако, отметить, что в состав инициаторного комплекса при репликации ДНК аденовирусов входит не сам ТБ, а его предшественник, имеющий мол. Д или кДб. Структура молекул терминального белка высоко гомологична меяду различными аденовирусами человека 1, обезьян , а такие меяду аденовирусами человека и птиц . Благодаря использованию специфических рестрикционных нуклеаз рестриктаз для многих серотипов аденовирусов человека и яивотных к настоящему времени построены подробные физические карты геномов 5,,7,7. Построены такие генетические карты геномов некоторых аденовирусов человека 1 с использованием классических тестов комплементации. В то яе время,для точной локализации генов, кодирующих отдельные белки вириона аденовирусов, необходимо применение трансляционных методов картирования. Эти методы предусматривают гибридизацию различных классов аденовирусных мРНК с фрагментами генома, образующимися под воздействием известных рестриктаз, с последующейтрансляцией в системах i vi 1,5. На рис. 2, полученная с помощью указанных методов 9. I.I. I.1. Наиболее полно продуктивный инфекционный цикл изучен для аденовирусов человека на линиях клеток КВ или i в суспензионных культурах, которые были инфицированы вирусом 2 с высокой мноявственностью инокуляции 0 бляшкообразующих единиц на клетку 8. Принято разделять инфекционный цикл аденовирусов на две фазы, раннюю и позднюю 7. Под ранней фазой инфекционного цикла подразумевается фаза, предшествующая репликации вирусной ДНК в хозяйской клетке. Рис. Транскрипционная карта генома аденовируса человека Ас. Треугольниками обозначены участки расщепления ДНК Ас эндонуклеазой Есо ЕсоИ Тонкими стрелками обозначены участки генома, соответствующие ранним оперонам генома Ас. Толстыми стрелками обозначены основные части индивидуальных поздних мРНК субоперонов . Скобками обозначены положения ранних промоторов и главного позднего промотора. РНК в общем содержании РНК в зараженной клетке относительно невелика. В опытах i . РНК, связанных с клеточными полисомами, гибридизуются с ДНК аденовирусов того же серотипа, то есть являются вирусспецифическими. Только небольшая часть информации, кодируемой геномом аденовирусов, экспрессируется в виде ранних мРНК, причем транскреп, ция ранних последовательностей происходит с обеих цепей генома. Эксперименты по гибридизации, выполненные с фрагментами генома 2, образующимися под действием различных рестриктаз, показали, что 9 1цепи и гцепи транскрибируются в мРНК в ранний период инфекции 6. В настоящее время установлена полная транскрипционная карта ранних оперонов 2 рис. Существует несколько подходов для изучения ранних полипептидов в зараженных аденовирусами клетках. Например, методами иммунофлуоресценции и иммунопреципитации показано присутствие как в ядре, так и в цитоплазме зараженных клеток нескольких видов Тантигенов 4,6. Тантигены вырабатываются в присутствии ингибиторов синтеза ДНК , что с полным основанием позволяет считать их ранними полипептидами. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле показано, что два главных вида Тантигена имеют мол. Д и кД, несколько минорных видов имеют мол. Д до кД для 5 6.