Селективная супрессия полимеразной цепной реакции - новый подход к анализу структуры и экспрессии сложных геномов

• Автор: Лукьянов, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 45 с. : ил.; 20х14 см

И ооз Ло х
Работа выполнена в Институте Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Научный консультант

доктор химических наук, академик РАН Е.Д. Свердлов

Официальные оппоненты

доктор химических наук Ю.А. Берлин

доктор химических наук, членкорр. РАН Л.И. Корочкин

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский

Защита состоится й декабря года в часов на заседании специализированного совета Д 2 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу ГСП7, Москва В7, ул. МиклухоМаклая .
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан г.

Ведущая организация
Институт биологии развития РАН
.А. Несмеянов
УУ О0 зиХ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность


Это позволяет отказаться от трудоемких и низкоэффективных методов физической сепарации различных фракций ДНК и делает разработанные на основе ССП методы более удобными, быстрыми и воспроизводимыми. Описанные в данной работе методы в настоящее время используются для решения широкого круга задач молекулярной биологии по изучению геномов и продуктов их экспрессии. Например, использование предложенных методов позволило нам выявить и клонировать полноразмерные кДНК копии ряда функционально важных генетических последовательностей, вовлеченных в регуляцию регенерации у планарий. Анализ экспрессии выявленных генов позволил впервые продемонстрировать индукционные взаимодействия в теле планарий при регенерации. Полученная информация о структуре таких генов может быть использована для создания лекарственных препаратов, обладающих высокой специфичностью действия. Выявление новых флуоресцентных белков с помощью описанных в работе методов открывает новые перспективы развития систем анализа экспрессии генов i vv, что имеет важное практическое значение для биотехнологии и медицины. Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях VIII Международном симпозиуме по клеточной дифференцировке Хиросима, , Руссконемецком симпозиуме по молекулярной и медицинской генетике Кельн, , Международном форуме по регенерации Миннеаполь, , Конгрессе Европейского общества по биологии развития Тулуза, , V ВсеросиЙскоЙ конференции Генная и клеточная инженерия Москва, , том Съезде Европейского биохимического общества Барселона, , Международной конференции по регенерации Кельн, . Циклы работ по созданию методов поиска и анализа дифференциально экспрессирующихся генов и по исследованию регенерации хрусталика глаза у тритона, в которых были представлены отдельные этапы этого исследования, получили премии МАИК Наука за год, а так же журнала Биоорганическая химия за и годы. Публикации. Диссертация обобщает данные основных публикаций. Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений исследований, разработке и экспериментальной проверке всех предложенных в настоящей работе методов, обсуждении и оформлении полученных результатов в совместных исследованиях с сотрудниками ИБХ РАН, ИБР РАН, ИЭМЖ РАН, института Биохимии РАН, Кардиологического Центра, Центра развития биотехнологии Бостонского университета США и i I. США. Предложенные в данной работе методики основаны на эффекте селективной супрессии полимеразной цепной реакции ССПэффекте. ССПэффект состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертироваными концевыми повторами ИКП в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП рис. I . Этот факт объясняется следующим образом. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация ИКП самоотжиг происходит раньше, чем отжиг праймера, поскольку температура самоотжига ИКП выше температуры отжига праймера. Только небольшая часть молекул ДНК достигает температуры отжига праймера без формирования структуры типа сковородка, закрывающей сайт посадки праймера. Те молекулы, на которые праймер всетаки отжегся, после синтеза ДНК восстанавливают исходную структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах ПЦР. Различия в температурах отжига ИКП и амплификационного праймера. Соотношение длины и вСсостава ИКП в целом и последовательности, соответствующей структуре праймера существенно влияют на эффективность ССП. Оптимальным представляется использование ИКП длиной п. Длина молекулы ДНК, несущей ИКП. Чем длиннее молекула, тем меньше вероятность встречи и внутримолекулярной гибридизации ИКП меньше концентрация концов молекулы относительно друг друга. Таким образом, ССПэффект не ингибирует или слабо ингибирует амплификацию очень длинных молекул ДНК пороговая длина зависит от конкретных условий, обычно она составляет т. Концентрация праймера в ПЦР.