Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки

• Автор: Некрасова, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список принятых сокращений Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Основные положения, выносимые на защиту

Публикации и апробация работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Вирус иммунодефицита человека первого типа

1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вирус

1.2. АнтиВИЧ иммунный ответ

1.2.1. Гуморальный иммунитет

1.2.2. Клеточный иммунитет

1.2.3. Мукозальный иммунитет П. Вакцины против ВИЧСПИД
2.1. Вакцины на основе аттенуированных вирусов
2.2. Субъединичные вакцины
2.3. Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ1 иммуногенов
2.4. ДНКвакцины
III. Способы доставки вакцинных препаратов
3.1. Микросферы
3.2. Вакцины на основе рекомбианантных вирусных векторов
3.3. Аггенуированные штаммы сальмонелл в качестве системы доставки антигенов
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы
2.2. Ферменты
2.3. Плазмиды
2.4. Бактерии
2.5. Культуральные и питательные среды
2.6. Вирусы
2.7. Растворы
2.8. Методы
2.8.1. Трансформация клеток Е.i плазмидной ДИК
2.8.2. Трансформация клеток сальмонеллы плазмидной ДНК
2.8.3. Выделение плазмидной ДНК
2.8.4. Ферментативный гидролиз ДНК
2.8.5. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.8.6. Элюция фрагментов ДНК из ПААГ
2.8.7. Конструирование рекомбинантных ДНК
2.8.8. Электрофоретический анализ белка
2.8.9. Иммуиоблотинг белков с иммунными сыворотками
2.8 Иммунизация лабораторных животных
2.8 Определение ЛД аттенуированных штаммов сальмонеллы
при перректальном введении
2.8 Исследование антигенной структуры сальмонелл
2.8 Исследование персистенции сальмонелл в органах лабраторных
животных
2.8 Иммуноферментный анализ
2.8 Реакция бласттрансформации
2.8 Определение специфических Iпродуцирующих клеток в
реакции I
2.8 Реакция вирусной нейтрализации
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Использование вирусоподобных частиц для доставки искусгвенного
белка I
3.1.1. Получение гибридного белка I и анализ его антигенных
свойств
3.1.2. Получение вирусоподобной конструкции кандидаткой вакцины
3.1.3. Конструирование ВПЧ, несущих ДНК вакцину
3.2. Иммуногенность экспериментальных вакцин
3.2.1. Схема проведения эксперимента
3.2.2. Оценка гуморального иммунного ответа
3.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных
животных
3.2.4. Клеточный иммунный ответ при введении экспериментальных
вакцин
3.3. Использование аттенуированных штаммов сальмонелл в качестве
системы доставки искусственного белка ТВ
3.3.1. Характеристика аттенуированных штаммов сальмонелл
3.3.2. Получение рекомбинантных штаммов сальмонеллы и
исследование продукции белка ТВ
3.3.3. Исследование биохимических и антигенных свойств
аттенуированных штаммов сальмонелл
3.3.4. Оценка стабильности плазмидных конструкций в клетках
сальмонеллы
3.3.5 Определение ЛД аттенуированных штаммов сальмонеллы при
ректальном введении
3.4. Иммуногенные свойства вакцинных штаммов сальмонеллы
3.4.1. Клеточный иммунный ответ при введении рекомбинантных штаммов
сальмонелл
3.4.2 Гуморальный иммунный ответ
3.5. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полиэпитопного
белка ТС
3.5.1. Антигенные свойства белка ТС
3.5.2. Иммуногенные свойства белка ТС
3.5.2.1. Клеточный иммунный ответ
3.5.2.2. Исследование гуморального иммунного ответа
3.5.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных
животных
Заключение
Выводы
Список публикаций
Список литерату


Это могло бы позволить решить проблему сохранения ДНК до того момента, как ВПЧ будет поглощена антигенпрезеитирутощими клетками и, таким образом, уменьшить эффективную дозу вакцины . I. . Другим перспективным способом представления ДНК вакцин иммунокомпетентным клеткам могут быть аттенуированные штаммы сальмонелл . . . Преимущество доставки ДНК вакцин с помощью сальмонелл заключается, вопервых, в непарентеральном способе введения, а вовторых, в том, что помимо системного гуморального и клеточного ответов активируется специфический мукозальный иммунитет, создающий на слизистых барьер для проникновения вируса в организм. Значимость мукозального иммунитета особенно высока для инфекций, передающихся через слизистые оболочки, именно к таким инфекциям и относится СПИД. Цель работы заключалась в разработке средств доставки полиэпитоиных иммуногенов ТВ I и исследование их свойств. Получить и исследовать иммуногенные свойства искусственных вирусоподобных частиц ВПЧ, экспонирующих на своей поверхности рекомбинантный белок I. На основе аттенуированных штаммов сальмонелл получить рекомбинантные штаммы, продуцирующие белок I. Оценить стабильность плазмиды XТВТ в клетках сальмонелл. Исследовать ее иммуногенность в составе ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл. Получить ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл, несущие ДИК вакцину I. Изучить иммуногенные свойства полученных конструкций. Научная новизна и практическая ценность. I. Были исследованы иммуногенные свойства полученных частиц ВПЧI. Было показано, что использование ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа и вызывает адъювантный эффект сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда. Получена ДНК вакцина, содержащая ген ТВ1 под контролем цитомегаловирусного промотора. Сконструированы вирусоподобные частицы, несущие ДНК вакцину, покрытую оболочкой из полиглюкина. Показано, что оболочка из полиглюкина защищает ДНКвакцину от действия нуклеаз сыворотки крови. Применение частиц в качестве средства доставки ДНК вакцины увеличивает уровень иммунного ответа как гуморального, так и клеточного и способствует его пролонгации. На основе аттенуированных штаммов iii Е и ii были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок I, а также рекомбинантные штаммы, несущие ДНК вакцину I. Показано, что рекомбинантные штаммы сальмонелл при ректальной иммунизации, способны стимулировать как системный, так и мукозальный гуморальный иммунный ответ. ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл были использованы в качестве систем доставки ДНК вакцины, кодирующей полиэгтитопный Тклеточный иммуноген I. Было показано, что введение кандидатных вакцинных конструкций вызывает стимуляцию ВИЧ специфического гуморального и клеточного ответа, причем образующиеся антитела обаладали нейтрализующей активностью в отношении трех штаммов ВИЧ1 субтипа В. В результате проделанной работы впервые была показана возможность использования вирусоподобных частиц и аттенуированного штамма сальмонеллы в качестве систем доставки полиэпитопных ВИЧ1 иммуногенов. Полученные конструкции легли в основу кандидатных вакцин против ВИЧ1, которые разрабатываются в ФГУН ГНЦ ВБ Вектор. Основные положения, выносимые на защиту. Фрейнда. Е и ii , продуцирующих белок I, приводило к индукции как системного, так и мукозального иммунитета. Использование систем доставки ДНК вакцины ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл способствовало развитию более выраженного иммунного ответа. ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонеллы ii I показали эффективность использования для доставки полиэпитопиого искусственного белка I. Апробация работы и публикации. Полученные результаты представлены на двенадцати международных конференциях. По материалам диссертации было опубликовано пять статей, два патента и получено одно положительное решение о выдаче авторского свидетельства.