Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli в отсутствие селективного маркера

• Автор: Саврасова, Екатерина Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

Введение

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

Обзор литературы

1. Генетическая рекомбинация

1.1. Гомологичная рекомбинация

1.2. Саитспецифнческая рекомбинация

1.2.1. Локусы рекомбинации

1.2.2. Специализированные рекомбиназы
1.2.3. Консервативность
1.2.4. Биологическая роль сайтспецифической рекомбинации
1.2.5. Функциональный кор
1.2.6. Этап расщепления и переноса нити
1.2.7. Область перекрывания
1.2.8. Дополнительные элементы
1.2.9. Контроль эффективности и выбора времени
сайтспецифической рекомбинации
1.2 Интегративная рекомбинация и рекомбинация исключения в Аинтегразной системе.
1.3. Транспозиция
1.3.1. Два типа реакций транспозиции
1.3.2. Различия между транспозицией и сайтспецифической
рекомбинацией
1.3.3. Классы транспозирующихся элементов
1.3.4. Транспозиция на молекулярном уровне
1.3.5. Инсерционныс последовательности
1.3.6. Сложные Iтранспозоны I класса
1.3.6.1. Элементы Тп 5 и Тп
1.3.7. Несложные транспозоны II класса
1.3.7.1. Элемент 3 и родственные ему транспозоны
1.3.7.2. Тп 7 сайтспецифический транспозон
1.3.8. Бактериофаг Ми
1.3.9. Внутримолекулярные и межмолекулярные перестановки
1.3 Концевые последовательности транспозонов
1.3 Сайты инсерции
1.3 Иммунность мишени
1.3 Кодируемые элементом транспозазы
1.3 Транспозоны в качестве генетического инструментария
2. Фагтранснозон Ми
2.1. Общая характеристика фага . i
2.1.1. Жизненный цикл. Литическое и лизогенное развитие
2.1.2. Физическая и генетическая карты фага Ми
2.1.3. Сайты
2.1.4. Гены
2.1.5. Влияние температуры на направленный перенос генов
2.2. Модели транспозиции фага Ми. Два механизма транспозиции
фага Ми консервативная и репликативная
2.3. Структура и функции концов генома фага Ми
2.4. Негативная регуляция транскрипции генами с и пег
2.4.1. Репрессорс
2.4.2. Оператор
2.4.3. Сайты связывания срепрессора
2.4.4. Рспрсссор пег
2.4.5. Сайты связывания репрессора пег
2.5. Трансиозаза Ми А
2.6. Энхансср транспозиции фага Ми
2.7. Нуклеопротеиновые комплексы в транспозиции Ми
2.8. Кофактор транспозиции белок В
2.9. Роль белка Ми В в реакции сборки транспозосомы. АТФАДФ переключатель
2 Модель контроля доставки мишени и переноса нити белком Ми В
2 Точки интеграции
2 Иммунность мишени
2 Репликационные белки . i
2 Белки I и
2 Производные фага
. ii элементы
. Системы для клонирования i viv
2 Системы i vi
Плазмидный мутагенез
. Мутагенез генома
3. Современные методы конструирования штаммовпродуценгов
3.1. Биосинтез треонина
3.2. Биосинтез валина
Материалы и методы
Результаты и обсуждение
1. Высокоэффективная транспозиция вектора ii
1.1. Сравнительная оценка эффективности транспозиции
транспозоиов 5, ii, ii ,
1.2. Стабильность полученных штаммов
2. Конструирование продуцента треонина с использованием интегративных 1 векторов
2.1. Проверка стабильности штаммовпродуцентов
3. Конструирование на основе элемента ii векторов, 5 обеспечивающих эффективную интеграцию и амплификацию генов, а
также стабильность полученных штаммов
3.1. Создание транспозиционного модуля.
Конструирование плазмиды рМНЮ
3.2. Конегруирование ii векторов, содержащих
антибиотический маркер
3.3. Оценка эффективности интеграции векторов, содержащих
антибиотический маркер
3.4. Стабильность штаммов, содержащих в хромосоме интегрированные
ii кассеты
3.5. Зависимость утраты плазмид ii вектора и модуля транспозазы
от наличия репрессора Ми в составе интегративного вектора
4. Конструирование безмаркернмх малоконийных интегративных 0 ii векторов
4.1. Получение рекомбинантной плазмиды рМ
4.2. Конструирование малокопийного интегративного ii вектора,
неспособного к автономной транспозиции
4.2.1. Конструирование плазмиды рМ
4.2.2. Клонирование терминатора транскрипции в вектор рМ
4.2.3. Конструирование плазмиды рМ
4.2.4. Конструирование интегративных векторов рМ и рМ
4.2.5. Определение места встраивания ii на векторе 7 и структуры интегративного вектора рМ
5. Эффективность разработанной ii системы в несслсктивных 0 условиях
5.1. Изучение эффективности интеграции генов биосинтеза аминокислот
5.2. Влияние терминации транскрипции внутри ii вектора на
эффективность интеграции
5.3. Эффективность интеграции в процессе первичной транспозиции
5.4. Амплификация ii кассет, интегрированных в хромосому
бактерии
5.5. Эффективность интеграции малокопийных интегративных ii
векторов.
6. Использование разработанной интегративной ii системы для 8 конструирования бесилазмидного штамманродуцента валнна,
не содержащего маркер антибиотической устойчивости.
Выводы
Список литерату


Алан Кэмбэлл предложил, что этот процесс осуществляется с использованием сайтов рекомбинации и генов, которые направляют их взаимное соединение ,. Позднее были открыты также другие системы сайтспецифической рекомбинации табл. В отличие от гомологичной рекомбинации, системы сайтспецифической рекомбинации используют относительно короткие специфические сайты связывания для рекомбинационных белков, осуществляющих рекомбинацию но данным сайтам. Сайтспецифическая рекомбинация происходит с участием пары сайтов, которые могут быть расположены в одном репликоне хромосоме или разных репликонах хромосома бактерий фаг. Такая чрезвычайная степень специфичности приводит к точно определнным генетическим перестановкам . Локусы рекомбинации. В типичной сайтспецифической рекомбинации, оба партнера несут хорошо определнный специфический сайт, который является необходимым для рекомбинационного события и который содержит точку генетического обмена. Отличительной особенностью локусов сайтспецифической рекомбинации является то, что они функционируют не отдельно, а в парах . Другое важное свойство локуса сайтспецифической рекомбинации полярность сайта рекомбинации. Этот локус часто не является палиндромом и, следовательно, имеет внутреннюю полярность. В норме рекомбинация происходит только когда пара сайтов рекомбинации непосредственно сопоставляются особым пространственным способом, таким образом, придавая как позиционную, так и ориентационную специфичность этим системам . Такая специфичность имеет важное биологическое значение кроме того, специфичность ориентации сайта приводит к формированию специфических топологий ДНК в продуктах рекомбинации. Специализированные рекомбиназы. Фактически в каждом случае специализированный белок, специфическая рекомбиназа, направляет рекомбинацию специализированных сайтов. Например, в случае бактериофага X, интеграция зависит от гена, соответственно названного i, который картирован рядом с локусом интеграции вируса. Подобным образом, многие но не все сайтспецифическис рекомбиназы картированы рядом с их сайтом действия, такое расположение может обеспечивать эффективные способы для их развития и распространения . Консервативность. Заключительная особенность, которая характеризует сайтспецифические системы консервативный характер рекомбинационного события. Данное описание применяется на нескольких молекулярных уровнях. Вопервых, никакая генетическая информация не утрачивается или не приобретается, как последствие рекомбинации последовательность перестроенных сегментов является просто перестановкой родительской ДНК. Вторая консервативная особенность сайтспецифической рекомбинации отсутствие репликации . Напротив, значительные уровни активности синтеза ДНК требуются как для гомологичной рекомбинации, так и для транспозиции. Третий уровень консервативности в сайтспсцифичсской рекомбинации термодинамический, т. АТФ, подразумевая, что энергия, запасенная в фосфодиэфириом остове ДНК сохраняется на каждом этапе перестановки . Это следует из факта, что сайтсиецифическне рекомбииазы является топоизомеразами, а не нуклеазами. Таким образом, вследствие специфичной и консервативной природы, системы сайтспсцифичсской рекомбинации являются точными и тонкими инструментами для перестраивания генома особенность, используемая как в природе, так и генными инженерами. Биологическая роль сайтспецифической рекомбинации. Причиной внушительного множества различных систем сайтспецифической рекомбинации являются такие немногочисленные биологические функции, как приобретение и устранение определенных сегментов ДНК, образование разнообразия в экспрессии гена, и понижение димерных форм. Данные системы участвуют в широком круге биологических процессов как в прокариотах, так и в эукариотах интеграция вирусов, антигенное изменение, контроль дупликации генов и числа копий, интеграция кассет, обуславливающих устойчивость к антибиотикам. В таблице 1 приводится классификация систем сайтспецифической рекомбинации, представленных в . Таблица 1. Системы сайтспецифичссокй рекомбинации . Изменение экспрессии гена i . Сокращение димеров хег . X . НК . Р2 .