Изучение взаимодействий РНК-полимеразы с однонитевыми и двунитевыми ДНК-аптамерами

• Автор: Феклистов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил.

Введение.

Методические аспекты процедуры X.

Аффинность и специфичность аптачеров.

Химические .модификации аптачеров.

Отличия РНК и ДНКаптачеров

Аптачерсвязывающие эпитопы белков и сложных .чишеней.

Структурные особенности аптачеров.

Структура ко.чтексов аптачеров с мишенями.

Аптачеры к бакам, взаимодействующим i viv с нуклеиновыми кислотами

МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У ПРОКАРИОТ

Основные события инициации

7факторы прокариот
Бактериальные промоторы.
Строение 7субъединицы, кор и холофер.чента прокариотической 1II.
Узнавание элемента промотора
Узнавание элемента промотора
Промоторы с удлиненным элементом
Роль 7субъединицы на ранних этапах элонгации
Взаимодействие свободной асубъединицы с ДНК
Применение синтетических днкконструкций для изучения РНКполимеразы
Матрицы с однонитевым хвостом
Матрицы с расплавленным участком
Минимачьные нукзеиновокисютные каркасы.
Промоторы с нарушениями структуры спирали ДНК.
Однонитевые ДНКолигонуклеотиды.
ДНКвилки.
Транскрипция на однонитевых и шпизечных ДНКструктурах
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды и антибиотики
Электрофорез нукчеиновых кислот в денатурирующем геле.
Проведение электрофореза без ков в ПААГ.
Выделение корфермента РНКП.
Выделение 7субъединицы РНКП.
Получение радиоактивномеченых олигонукзеотидов.
Получение аптачеров к корРНКП
Получение аптачеров к асубъединице РНКП Т. i.
Опредезение нуклеотидной последовательности ДНК.
Измерение Кд комплексов олигонуклеотидов с РНКП.
Измерение кинетики диссоциации комплекса аптачера с РНКП
Эксперименты с миничачьным нуклеиновокисютным каркасам.
Футпринтинг гидроксильными радикалами.
Получение дцЦНК для проведения экспериментов по транскрипции i vi.
Транскрипция i vi.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
Аптампры к корферменту РНКполимеразы
Получение и общая характеристика аптачеров
Влияние 7субъединицы и фактора на взаимодействие аптачеров с корферментом
Специфическое и неспецифическое взаимодействие аптачеров с главным каналом РНКП
АПТАМЕРЫ К ОСУБЪЕДИНИЦЕ РНКП Г. I
Получение и общая характеристика аптачеров
Сравнение последовательности аптачеров и бактериазьных промоторов.
Ингибирование синтеза РНК i vi аптичеричи к осубъединице.
Взаимодействие аптачеров к изолированной осубъединице с холофер.чентом РНКП
ДВУПИТЕВАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АПТАМЕРОВ К ОСУБЪЕДИНИЦЕ РНКП Т. I, ЯВЛЯЕТСЯ ПРОМОТОРОМ НОВОГО ТИПА, СПЕЦИФИЧНЫМ ДЛЯ РКП Г. I
Температурная зависимость активности РНКП Т. i и . i на аптамерном промоторе Активность гибридных холоер.ментив. Влияние гепарина на активность РНКП на аптамерном
промоторе .
Активность холоферментов, содержащих мозаичную сигмасубъединицу Т. с районом
осубъединицы . i.
Роль консервативных элементов аптамерного промотора в инициации транскрипции
Транскрипция на однонитевых ДНК лптлмпрлх к аСУБЪСДИНИНЕ I1КП.
Роль осубъединицы при транскрипции на однонитевых аптамерах
Транскрипция на однонитевых аптамерах при повышенной ионной силе
ВЫ ВОДЫ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Структура контактов РНКП с промоторными последовательностями на разных этапах узнавания промотора остатся не изученной. При переходе к элонгации транскрипции контакты с промоторными последовательностями разрываются, происходит диссоциация асубъединицы. Элонгация транскрипции осуществляется корферментом РНКП. Па этой стадии полимераза контактирует с ДНК однонитевой и двунитевой и РНК в основном сиквснснеспецифичсски эти контакты позволяют ферменту довольно прочно удерживать матрицу и, в тоже время, быстро по ней перемещаться. В процессе этого движения, при добавлении новых нуклеотидов в растущую цепь РНК, а также на стадии терминации фермент претерпевает конформационные изменения, детальные механизмы которых изучены плохо. Алтамерами называют однонитевые РНК или ДНКлиганды к различным мишеням, получаемые направленным отбором из большого числа различных последовательностей. Было показано, что аптамеры, полученные к белкам, i viv контактирующим с нуклеиновыми кислотами ПК, обычно имитируют природные НКбелковые взаимодействия. Кроме того, аптамеры часто оказываются ингибиторами своих мишеней. Таким образом, аптамеры к РПКполимеразе могут послужить удобной модельной системой для изучения взаимодействий этого белка с нуклеиновыми кислотами. Целью работы являлось получение алтамеров к корферменгу и осубъединице РНКП и изучение их взаимодействий с РНКП. Получить ДПКаптамсры к корферментам РНКП ii i и i, а также к осубъединице РНКП i. Исследовать механизмы узнавания алтамеров корферментом и осубъединицей РНКП. II. Изучить транскрипционные свойства алтамеров в однонитсвом и двунитевом состоянии. Получены и охарактеризованы высокоаффинные ДНКаптамсры к корферментам РНКП ii i и i. Показано, что аптамеры являются эффективными ингибиторами транскрипции, стсубъединица, а также фактор элонгации транскрипции подавляют связывание алтамеров с РНКП. При помощи аптамеров к РНКП . РКП. Получены ДПКаптамеры, которые взаимодействуют с изолированной стсубъединицей Т. Аптамеры к осубъединице содержат последовательность области промотора, окруженную дополнительными консервативными мотивами. Таким образом, впервые показано, что асубъеднница в свободном состоянии способна узнавать промоторные последовательности ДНК. На основе однонитевых аптамеров к стсубъединицс Т. РНКП Т. Отобранные в работе аптамеры предполагается использовать в дальнейших структурнофункционазьных исследованиях РНКП. Кроме того, результаты работы могут найти практическое применение для создания высокоэффективных промоторов новою типа, а также для получения новых ингибиторов транскрипции. Метод X i vi i xi i позволяет получать олигонуклеотидыые лиганды, обладающие высоким сродством и специфичностью, практически к любой молекулярной мишени. Такие лиганды получили название аптамеров от лат. Метод был придуман в году Голдом и Шостаком, одновременно и независимо , i , . Одноцепочечная нуклеиновая кислота длиной п нуклеотидов может образовывать 4П Ю0,6п вариантов различных последовательностей. Аптамеры отбираются i vi из комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов, которая содержит обычно около различных молекул. Последовательность олигонуклеотида определяет его трхмерную структуру и способность взаимодействовать с другими молекулами. Вполне вероятно, что среди такого многообразия найдтся олигонуклеотид, который окажется хорошим лигандом к конкретной молекулярной мишени. Отбор в методе X эволюция i vi состоит из повторяющихся циклов связывания библиотеки с мишенью и амплификации связавшихся последовательностей. Уникальная трхмерная структура аптамеров обеспечивает их способность связывать различные молекулы от неорганических ионов, до сложных белковых комплексов. Сродство и специфичность к некоторым мишеням превышает таковые у моноклональных антител. В данном обзоре предпринята попытка рассмотреть применение метода X в биологических иелледованиях, особое внимание будет уделено получению и свойствам аптамеров к белковым молекулам. Это искусство позволит вам созерцать различные сочетания из двадцати трх букв. Анатомия меланхолии, ч. II, м. IV X.