Структурно-функциональное изучение ДНК топоизомеразы V Methanopyrus kandleri

• Автор: Белова, Галина Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил

1. ТОПОЛОГИЯ ДНК ОСНОВНЫЕ понятия.

2. ТОПОИЗОМЕРАЗЫ ФЕРМЕНТЫ, ИЗМЕНЯЮЩИЕ ТОПОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ДНК ПОСРЕДСТВОМ РАЗРЫВА И ВОССОЕДИНЕНИЯ ПОЛИНУКЛЮТИДНЫХ ЦЕПЕЙ.1

3. ТОПОИЗОМЕРАЗЫ КЛАССА .

3.1. Эубактериальные топоизомерозы I

3.2. Эубактериальные топоизомерозы III

3.3 Эукариотические топоизомерозы III.

3.4. Обратные гиразы

4. ТОПОИЗОМЕРАЗЫ КЛАССА I.

4.1. Эукариотические топоизомерозы I

4.2. Топоизомерозы поксвирусов.

4.3. Топоизомераза V i

5. ТОПОИЗОМЕРАЗЫ КЛАССА II
5.1. Эубактериальные топоизомерозы II или ДНК гиразы
5.2. Эубактериальные топоизомерозы IV.
5.3. Топоизомераза II фага Т4.
5.4. Эукариотические топоизомерозы II.
6. Общие черты в строении и механизме действия топоизомерлз классов I и ПА
7. ТОПОИЗОМЕРАЗЫ КЛАССА ИВ.
8. Биологические функции ДНК топоизомераз
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .
1. Клонирование
1.1. Создание библиотеки геномной ДНК i на основе фага Л
1.2. Титрование фаговой библиотеки
1.3. Блотинг по Саузерму
2. МЕТОДЫ очистки белков.
2.1. Выделение топоизомеразы V из архебактериапьного микроорганизма i.
2.2. Выделение рекомбинантных ферментов.
3. Ферментативный гидролиз Топо V и определение концевой аминокислотной
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА
3.1. Стандартная методика ферментативного гидролиза.
3.2. Определение массового соотношения ДНК Топо V. при котором образуется нерастворимый комплекс ДНКфермент.
3.3. Влияние ДНК на протеачиз.
3.4. Гидролиз с помощью трипсина, химитрипсина, термолизина, протеаз У8 и .
3.5. Определение концевой аминокислотной последовательности продуктов протеолиза
4. Определение топоизомеразной активности
4.1. Стандартная метхика определения топоизомеразной активности.
4.2. Определение единицы активности Топо V, Топо и Топоб.
4.3. Зависимость релаксации отрицательно сверхспирапизованной плазмидной ДНК от температуры
4.4. Зависимость релаксации отрицательно сверхспирапизованной плазмидной ДНК от концентрации солей К .
4.5. Релаксация отрицательно сверхспирапизованной плазмидной ДНК в присутствие солей
2 и Со2.
4.6 Эффект расппетания цепей
4.7. Формирование ковалентного комплекса Топо VДНК.
Изучение взаимодействия Торо с ДНК.
6. Определение лиазных активностей Топо V
6.1. Приготовление субстратов.
6.2. Стандартная методика определения АР и лиазных активностей Топо V.
6.3. Сопоставление топоизомеразной. АР и лиазных активностей Топо V.
6.4. АР и лиазные активности Топо V при С и С
6.5. Сравнение лиазных активностей Топо У и ТопоУМ6.
6.6. Определение сродства Топо У к АР и субстратам
ЯУЛЬТАТЫ. 1М1М1М1МНМНти1ММ1НМ1МНММН1ИММ
1. Исследование гена, кодирующего топоизомеразу V i и получение РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
1.1. Клонирование гена, кодирующего топоизомеразу V i.
1.2. Анапиз первичной структуры топоизомеразы У i.
1.3. Получение и очистка рекомбинантной топоизомеразы УМ. i
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ДОМЕНОВ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ V I.
2.1. Определение доменной организации топоизомеразы У методом ограниченного ферментативного гидролиза.
2.2. Клонирование и выделение рекомбинантных белков, являющихся отдельными доменами топоизомеразы V
2.3. Изучение функциональных свойств рекомбинантных белков Топо, ТопобI и Топо
3. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ТОПОИЗОМЕРАЗЫ V МЕТНА 1, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕГО РЕЛАКСИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА.
3.1. Определение тирозина, входящего в активный центр топоизомеразы V.
3.2. Анализ участка Топо V, содержащего тирозин, входящий в активный центр фермента
4. Изучение лиазных активностей топоизомеразы V
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Сравнение биохимических свойств топоизомеразы V и топоизомераз, принадлежащих к
КЛАССУ I
2. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА И И АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ V.
3. Доменная организация топоизомеразы V
4. Определение остатка тирозина входящего в активный центр топоизомеразы V.
5. Участие топоизомеразы V в эксцизионной репарации ДНК
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ .
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Топоизомераза V является односубъединичным белком с молекулярной массой 2 кДа, что укладывается в интервал 5 кДа, определенный для топоизомераз 1В. Фермент вносит разрыв в нуклеотидную последовательность, специфическую для одной из эукариотических топоизомераз и узнается антителами к топоизомеразе I человека. Однако, условия, в которых работают топоизомераза V и остальные ферменты этого класса, сильно различаются. Топо V М. Неп работает при температурах до 2С и в широком интервале солевых условий от мМ до 3. М. Оптимальной концентрацией соли являются 0. М С1 или 1. М КФи, что значительно превышает оптимальные концентрации солей, в которых работают известные топоизомеразы типа 1В. Такие экстремальные условия, необходимые для активности топоизомеразы V, легко объяснимы, поскольку МеМапоругив капсЛеп живет при высокой температуре и высокой концентрации соли. Структурнофункциональное изучение топоизомеразы V, выделенной из архебактериального организма, и обладающей биохимическими свойствами, присущими эукариотическим топоизомеразам, позволяет получить новые данные о свойствах этого уникального фермента и внести определенный вклад в исследование эволюционных взаимоотношений эукариот и архебактерий. Целью данного исследования являлось структурнофункциональное изучение топоизомеразы V, выделенной из архебактериального микроорганизма МеМапоругив капсЛеп. По своим биохимическим свойствам фермент принадлежит к топоизомеразам класса В. Прежде всего, следовало идентифицировать ген, кодирующий топоизомеразу V, попытаться установить родственные связи с другими ферментами на основе анализа аминокислотных последовательностей и сконструировать экспрессионную плазмиду для выделения рекомбинантного белка. Получение в чистом виде рекомбинантных белков, являющихся отдельными доменами фермента, позволило бы охарактеризовать их функции. Особое внимание было уделено поискам тирозина, входяшего в активный центр топоизомеразы V, образующего ковалентную связь с 3 концом ДНК во время топоизомеразной реакции. Для выполнения этой задачи получили мутантных белка, содержащих одну точечную замену остатка тирозина на фенилаланин. Установление гомологии первичной структуры отдельных районов топоизомеразы V и эукариотической рполимеразы позволило сделать предположение о том, что топоизомераза V способна осуществлять лиазные реакции эксцизионной репарации ДНК. Для проверки этой гипотезы провели эксперименты по определению АР и бИР лиазных активностей. В настоящей работе определен и проанализирован новый ген, кодирующий топоизомеразу V МеМапоругиз капсЛеп. Первичная структура данного белка имеет мало общего с известными ферментами, контролирующими топологию ДНК. В Сконцевой аминокислотной последовательности Топо V обнаружили ДНК связывающие мотивы типа спиральшпилькаспираль НИН. Мотивы НИН не встречаются у других топоизомераз, но характерны для многих других ферментов, работающих с ДНК. Особый интерес представляет факт гомологии участка Топо V и домена рполимеразы, обеспечивающего лиазные реакции этого фермента в эксцизионной репарации ДНК. В данной работе провели эксперименты, которые выявили АР и бИР лиазные активности топоизомеразы V. Таким образом, фермент МеМапоругиз капсвп является первой топоизомеразой, способной осуществлять реакции, относящиеся к эксцизионной репарации ДНК. С помощью точечного мутагенеза определили тирозин, входящий в активный центр фермента, образующий ковалентную связь с ДНК в процессе топоизомеразной реакции. Показали, что топоизомеразная и репарационная функции Топо V разграничены в пределах одного белка и релаксирующая активность фермента не влияет на выполнение лиазных реакций. Предложено и успешно осуществлено на практике использование Топо V в реакции секвенирования для улучшения определения последовательностей молекул ДНК, имеющих сильно выраженную вторичную структуру или сложное топологическое строение. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты настоящей работы были доложены на международных конференциях Термофилы г. Брест, Франция, Малые геномы г. Лейк США, на международных семинарах по программе ННМ1 в г в Варшаве Польша и в Вашингтоне США в г.