Взаимодействие рибосомного белка L1 с рибосомной и матричной РНК

• Автор: Никонова, Екатерина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Введение

ЯРБА ОПЕРОМ.

агопЕРОН
Бтдопеюн.
БРС ОПЕРОН.

Б кр0 оперой

ЫЫ1 оперой
Б ОПЕРОН.

и0ЯР1Л. ОЛЕГОМ.

Ь ОПЕРОН.
Заключение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ нимин1и1мнмми1ммминин1ииимиттинниммимм1и1имжмиммми
1. Материалы.
. I. Химические реактивы и ферменты
1.2. Буферы.
1.3.Сред ы
1.4. Бактериальные штаммы, векторы и плазмиды использованные в работе.
1.5. Принадлежности и приборы.
2. МЕТОДЫ
2.1. Методы генной инженерии и микробиологии
2.2.Выделение и очистка баков.
2.3.Выделение и очистка РНК.
2.4. Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков.
2.5. Получение и аначиз РНКбаковых комплексов т i
2.6. Получение и кристаллизация РНКбелковых комплексов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ и. .
1.ПОЛУЧЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ РНКБЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1.1. Конструирование фрагментов мРНК
1.2 Клонирование генов специфических фрагментов мРНК
1.3. Получение фрагментов мРНК в препаративных количествах
1.4 Определение сродства фрагментов мРНК к рибосомному белку Б1.
1.5. Выделение и очистка рибосомных белков Ы
1.6. Приготовление камтексов РНК для кристагчизации.
1.7. Кристаллизация РНКбелковых комплексов бака И со специфическгсми фрагментами мР НК. .
1.8. Структура комтексов МаБ1мРНК и ПИИмРНК
1.9. РНКбелковое узнавание.
2. Получение мутантных форм белка 1Л с измененными Р1 Жсвязывающими свойствами
2.1. Стратегия сайтнаправленного мутагенеза
2.2. Тестирование термостабилыюсти
2.3. Взаимодействие .мутантных форм белка Ы со специфическими фрагментами Б рРНК и мР НК.
2.4. Кристаллизация мутантных форм бака МаЫ с измененными РНКсвязывающими свойствами. .
ВЫ ВОДЫиН.ИИН.ИН4НН.МММ.И.МНН.ИННИИНН1ИЖаМИ1Н1Н.И.1МИ1ННН1НИНтНН1Н1НШШН1Н1.НН1
СПИСОК ЛИТЕР АТУ РЫ.
ОСТИ
ВВЕДЕНИЕ


Шпильки I и II высокостабильны, тогда как шпилька III, содержащая старткодон в большой апикальной петле и деградированный подобный элемент в спиральной части, обладает значительно меньшей стабильностью. Само по себе такое расположение старткодона и деградированной последовательности не должно мешать связыванию рибосомы, так как шпилька III очень слабая i v i, . Однако, неэффективен как последовательность для инициации трансляции , v, и поэтому не может дать высокий уровень трансляции . Так как делении в участке от нуклеотида до старткодоиа разрушают все шпильки, влияя как на активность, так и на аутогенный контроль, то предполагается, что именно участок инициации трансляции играет важную роль в обоих процессах, поскольку его вторичная структура у всех исследованных представителей бактерий одинакова i, . Помимо подобия вторичных структур нуклеотдные последовательности этого участка содержат ряд консервативных элементов i , . Вопервых, все они содержат деградированный подобный элемент в слабой спирали III и в петле. Вовторых, во всех случаях шпильки разделены богатыми участками. Втретьих, шпильки I и II содержат внутренние петли или выпетливания, которые могут участвовать в образовании третичной структуры. И, последнее, петли сильных шпилек I и II содержат последовательности. Таким образом, учитывая филогенетическую схожесть, можно предположить, что структура участка инициации трансляции Е. Методом сайтнаправленного мутагенеза было показано, что одновременное присутствие двух в апикальных петлях I и II необходимо для высокой трансляционной активности участка инициации трансляции . Оба элемента должны присутствовать одновременно, так как при замене любого из них на или удаление шпильки I ведет к одинаково резкому снижению активности. Замена только одного или соседних с ними нуклеотидов так же дает отрицательный эффект i , . Поскольку короткие элементы последовательности, расположенные далеко от канонического сайта связывания рибосомы примерно от старткодона , , сильно влияют на эффективность трансляции, они могут напрямую взаимодействовать с рибосомой. РНК 3 конец РНК и белок 1. Так как, согласно данным футпринтинга 1 не взаимодействует с петлями I и II, можно предположить, что формируют пространственный прерывистый элемент, который и взаимодействует с анти последовательностью РНК. Замена 9А на рис. Повидимому, отсутствие канонического элемента помогает свободному белку 1 конкурировать с субчастицей за связывание с участком инициации трансляции i , . Двойная мутация 8 на С и С на рис. Скорее всего, это вызвано реорганизацией шпильки III в более стабильную локальную структуру, где старткодон частично спарен. Следовательно, деградированный элемент необходим для обеспечения аутогенного контроля синтеза белка 1 без значительного изменения естественной трансляционной активности участка инициации трансляции , и высокая активность участка инициации трансляции не зависит от канонического взаимодействия анти последовательностей i . Две точечные мутации С на в положениях и рис. II, закрывая консервативную внутреннюю петлю. Эти мутации сильно ослабляют аутогенный контроль и увеличивают активность трансляции. Скорее всего, упрочнение нижней части шпильки II препятствует образованию прочного репрессорного комплекса. При введении замены в положение , аутогенный контроль подавляется сильнее, чем при мутации в положении . Видимо, при такой замене нижняя часть спирали становится еще более стабильной. Если посмотреть на окружение нуклеотида при данной замене, то видно, что оно представляет собой классический элемент. Однако, нуклеотидов, отделяющие его от старткодона, представляют собой слишком большое обычно это 5 нуклеотидов расстояние ii, . Кроме того, нет возможности образовать шпильку, чтобы сблизить элемент и . При введении дополнительной замены С на образуется С пара, и спираль восстанавливается i , восстанавливается активность до уровня дикого типа. Таким образом, нижняя часть спирали и внутренняя петля шпильки II служат для достижения правильного баланса между эффективной трансляцией и аутогенной репрессией.