Идентификация и функциональный анализ клеточных генов, дифференциально экспрессирующихся в результате инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей

• Автор: Никифорова, Наталия Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляция активности клеточных генов при ннФекпии альфавнрусами

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЬФАВИРУСОВ

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ ПРИ ИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЛОШАДЕЙ

Противовоспалительные гены

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ ПРИ ИНФЕКЦИИ СИНДБИС ВИРУСОМ

Цитокины
Иа КА ТФаза
Стрессактивируемые белки
Семейство клеточных генов Вс12
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Оборудование
МАТЕРИАЛЫ
Реактивы
Ферментативные препараты
Штаммы вирусов
Штаммы бактерий
Линии клеток
Питательные среды
МЕТОДЫ
Клетки и вирусы
Синтез к ДНК
Вычитание кДНК
Конструирование библиотек и скрининг
Радиоактивное мечение фрагментов ДНК
ЯТРСЯ
Секвенирование и анализ последовательностей
озерн блотгибридизация
Олигонуклеотидные праймеры
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Клетки, инфицированные ВЭЛ и ВКЭ
Конструирование и анализ дифференциальных библиотек
ЯТРСЯ анализ
Супрессия мРНК гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н при инфекции ВЭЛ Индукция мРНК спермидинспермин ацетилтрансферазы при инфекции ВЭЛ Индуцируемая мРНК БЯАТ продукт альтернативного сплайсинга
Нозерн блот анализ уровня транскрипции альтернативно сплайсированной мРНК БЭАТ
Альтернативно сплайсированная мРНК ББАТ полиаденилируется
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ СПЕРМИДИНСПЕРМИН
ЛЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЬ
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СПЕРМИДИНСПЕРМИН АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ПРИ ИНФЕКЦИИ АЛЬФА И ФЛАВИВИРУСАМИ
МЕХАНИЗМ АГ0ПТА В КЛЕТКАХ С ИНДУЦИРОВАННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ СПЕРМИДИНСПЕРМИН ЫАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОГЕННОГО ЯДЕРНОГО РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНА Н
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящей работе эта методика была применена для исследования клеточного ответа на инфекцию вирусами Венесуэльского энцефалита лошадей ВЭЛ, род vi, семейство vii и клещевого энцефалита ВКЭ, род vivi, семейство vivii в двух типах клеточных линий эмбриональной почки человека. Штаммы вирусов и клеточные линии выбирались с целью идентификации дифференциально регулируемых генов и сравнения их экспрессии в клетках, продуцирующих высокие и низкие титры вирусных частиц а также в клетках, подвергающихся литическому и персистентному типам инфекций. Род vi в настоящее время включает в себя признанных видов, каждый из которых, в свою очередь, подразделяется на многочисленные географические варианты и штаммы. Отнесение вида к роду vi основано на серологических кроссреакциях с одним или более из уже охарактеризованных видов. На основе данных по первичным структурам РНК и серологической кроссреактивности альфавирусы разделяются на три большие группы вируса Венесуэльского энцефалита лошадей группа ВЭЛ, вируса ii группа СФВ и вируса Синдбис группа СВ. Два обычно изучаемые в лабораториях вируса СВ и СФВ, считаются авирулентными для человека. Их лабораторные штаммы не вызывают заболеваний в ходе лабораторного инфицирования, за исключением хорошо известного случая энцефалита ii со смертельным исходом у работника лаборатории i . Тем не менее, природные варианты этих вирусов вызывают заболевания у людей. Альфавирусы имеют икосаэдрический нуклеокапсид, заключенный в плотно прилегающую оболочку, гликопротеиновые компоненты которой образуют икосаэдрическую решетку. Вирион имеет строго упорядоченную структуру, и вариабельность составляет не более 0,50,8 нм в любой части частицы i . Альфавирусный нуклеокапсид содержит одноцепочечный плюсРНК геном размером около ,7 нт, связанный с многочисленными копиями одною капсидного белка массой около кДа. РНК внутри нуклеокапсида чувствительна к деградации РНКазами, а индивидуальные субъединицы капсидного белка взаимодействуют друг с другом, формируя пента или гексамеры. Диаметр нуклеокапсида СВ составляет нм но данным рассеяния рентгеновских лучей интактными вирусными частицами . i . , . Выделенные нуклеокапсиды стабильны и имеют коэффициент седиментации 0. Так как высокая концентрация соли более 1 М вызывает распад капсида , , то для стабилизации капсида и, вероятно, для его сборки важны электростатические взаимодействия, что, в свою очередь, предполагает наличие связывания между высокоосновным концевым доменом капсидного белка и вирусной РНК. Оболочка вириона состоит из липидного бислоя, в который погружены многочисленные копии двух кодируемых вирусом гликопротеинов. Липидный бислой состоит из липидов, происходящих из плазматической мембраны клеткихозяина, и его состав близок к составу клеточной плазматической мембраны. В случае СВ он имеет толщину 4,8 нм и радиус ,3 нм . Вследствие сильной изогнутости бислоя внешний слой имеет площадь на больше, чем внутренний слой. Два гликопротеина, и Е2, имеют молекулярную массу около кДа и заякорены в мембране Сконцсвой областью. Белок Е2 СВ состоит из 3 аминокислот и содержит плазматический домен из аминокислот, следующий за мембранным доменом. Белок имеет длину 9 аминокислот и цитоплазматический домен длиной только 2 аминокислоты. Белки и Е2 гликозилированы, но число и положение гликозидных цепей не вполне консервативны среди альфавирусов. Белок обычно несет однудвс гликозидных цени, а Е2 две или три. У СВ и СФВ белки и Е2 также содержат ковалентно связанные остатки пальмитиновой кислоты внутри или около мембранного домена i М. Один из них связан с , и от четырех до шести связанны с Е2. Белки Е2 и образуют стабильный гетсродимср, который не разрушается при обработке вируса слабыми детергентами. Три гетеродимера Е2Е1 взаимодействуют с образованием выступа на поверхности вируса i , .