Топоизомераза II и ее участие в незаконной рекомбинации : Эксперименты в модельной системе

• Автор: Иванова, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Содержание
Содержание

Список сокращений и терминов, использованных в работе

Введение

Обзор литературы

Точки разрывов при хромосомных перестройках

Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания.

Группы химерных белков.

Кластеры точек разрыва.

Механизм рекомбинации

Структура белка и кажущаяся кластеризация точек разрыва

Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек
Структура и механизм действия топоизомераз II типа.
Основные свойства топоизомераз II
Структура белка
Механизм действия
Клеточная роль топоизомеразы II
Репликация.
Транскрипция.
Конденсация хромосом.
Рекомбинация.
ч..
Ингибирование топоизмеразы II
Постановка задачи и методические подходы.
Материалы и методы.
Приготовление и трансформация компетентных клеток . i.
Трансформация бактериальных клеток
Манипуляции с плазмидной ДНК
Полимеразная цепная реакция.
Выделение бакмидной ДНК из бактерий.
Положительная селекция клонов, содержащих I.
Декатенация плазмид.
Инду кция незаконной рекомбинации i vi
Трансфекция.
Выделение плазмидной ДНК из эукариотических клеток
Радиоактивное мечение олигонуклеотидов и гибридизация их с ДНК
Обработка ядер микрококковой нуклсазой и Саузернгибридизация.
Конструирование плазмид.
Результаты исследования и их обсуждение.
Создание модельной системы для количественной оценки частоты незаконной
i4
рекомбинации
Проверка функционирования гена 1
Декатенирование модельных конструктов.
Количественная оценка частоты незаконной рекомбинации.
Индукция незаконной рекомбинации i vi.
Эксперименты i viv
Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках
Индукция незаконной рекомбинации i viv и влияние ингибиторов
Предположительная модель действия топоизомеразы II
Картирование участков разрыва в рекомбинантных плазмидах
Нуклсосомный статус трансфецироваиных модельных плазмид
Выводы .
Список литературы


Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания. Группы химерных белков. Кластеры точек разрыва. Структура и механизм действия топоизомераз II типа. Репликация. Транскрипция. Конденсация хромосом. Рекомбинация. Постановка задачи и методические подходы. Материалы и методы. Приготовление и трансформация компетентных клеток . Полимеразная цепная реакция. Выделение бакмидной ДНК из бактерий. Положительная селекция клонов, содержащих I. Декатенация плазмид. Трансфекция. Обработка ядер микрококковой нуклсазой и Саузернгибридизация. Конструирование плазмид. Результаты исследования и их обсуждение. Декатенирование модельных конструктов. Количественная оценка частоты незаконной рекомбинации. Индукция незаконной рекомбинации i vi. Выводы . Благодарности. Список сокращений и терминов, использованных в работе. За последние годы появилось много данных, свидетельствующих о том, что противоопухолевая химиотерапия с использованием агентов, специфичных в отношении топоизомеразы II, очень часто вызывает вторичные лейкозы, для которых характерны определенные хромосомные перестройки 12. Топоизомераза II относится к семейству ДИКтопоизомераз ферментоврегуляторов топологического состояния ДНК 34. Этот фермент способен снимать топологические напряжения в ковалентнозамкнутых молекулах ДНК или в петельных доменах в случае эукариотических геномов и разделять катенаны путем внесения, временных двуцепочечных разрывов в ДНК. В определенных условиях в частности, при подавлении лигирующей активности фермента такие разрывы стабилизируются, что может привести к хромосомным аберрациям 5. Клетка обладает двумя основными механизмами репарации двуцепочечных разрывов один из них основан на гомологичной рекомбинации , ii, , другой на негомологичном соединении концов ДНК поп ii, . Для гомологичной рекомбинации необходимы протяженные области гомологии между репарируемыми участками, при этом возможно полное восстановление последовательности ДНК. Белковый комплекс, осуществляющий , соединяет тупые или липкие концы ДНК даже при полном отсутствии гомологии. Считается, что этот комплекс осуществляет процессинг концов двуцепочечных разрывов, который может вести к делеции, дупликации или инверсии фрагментов коротких ДНК 5. Топоизомераза II, повидимому, способна осуществлять негомологичную или незаконную рекомбинацию i vi 67. В настоящее время рассматривается два механизма возникновения рекомбинаций при участии ДНКтопоизомеразы II. В соответствии с первой моделью модель субъединичного обмена топоизомераза II и вносит двуцепочечные разрывы в ДНК, и репарирует их за счет своей лигазной активности 89. При этом не исключн обмен субъединиц между молекулами топоизомеразы II, связанными с разными участками хромосомы хромосом. Это приведт к незаконной рекомбинации, проявлением которой могут быть те или иные хромосомные перестройки. Согласно альтернативной, индукционной модели, топоизомераза II только вносит двуцепочечные разрывы, а их репарация происходит за счет других клеточных систем . Л . II доксорубицин, амсакрии, тенипозид, этопозид блокируют ее религирующую активность и оставляют ДНК в состоянии двуцепочечного разрыва, скрытого молекулой фермента . Такие разрывы, повидимому, рспарируются путем . Достоверно показано, что этот путь репарации часто приводит к неправильному соединению концов ДНК особенно в тех случаях, когда разрывов много. Таким образом, топоизомераза II представляет большой интерес и с теоретической, и с практической точки зрения. Механизм действия и клеточные функции этого фермента до конца неясны. Кроме того, топоизомераза II представляет большой интерес как мишень противоопухолевых лекарств. Все это определяет большую важность дальнейшего изучения топоизомеразы II.