Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека

• Автор: Иванова, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

1.1. Общая схема терминации трансляции

1.2. Факторы терминации трансляции первого класса

1.3. Факторы терминации трансляции первого класса

1.4. Декодирование стопкодона факторами терминации трансляции первого класса

1.5. Гидролиз пептидилгР1 I в пептидилтрансферазном центре

1.5.1. Молекулярная анатомия пептидилтрансферазного центра

1.5.2. Роль рРНК в реакции гидролиза нептидилтРНК

1.5.2. Роль факторов терминации трансляции первого класса в реакции гидролиза пептидилтРНК

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды

2.1.2. Среды
2.1.3. Реактивы
2.1.4. Ферменты
2.1.5. Олигонуклеотиды
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из .i
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК
2.2.4. Трансформация . i плазмидной ДНК
2.2.5. Полимеразная цепная реакция ГТЦР,
2.2.6. Сайтнаправленный мутагенез методом мегапраймера
2.2.7. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе
2.2.8. Сверхэкспрессия в . i и выделение мутантных форм
человека
2.2.9. Сверхэкспрессия в . i и выделение изолированного М домена 1 человека и его мутантной формы 3 А, меченных стабильными изотопами и ,3С
2.2 Электрофорез белков в денатурирующем ПЛАГ
2.2 Измерение спектров ЯМР и их анализ
2.2 Расчет структуры
2.2 Анализ динамических свойств
2.2 ЯМРтитрованпе субчастицами рибосом
2.2 Определение активности
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение структуры Мдомена человека в растворе
3.1.1. Отнесение сигналов атомов основной белковой цепи и боковых цепей аминокислотных остатков Мдомена
3.1.2. Определение вторичной и третичной структуры МдомсиасРР1 человека
3.1.3. Анализ структуры Мдомена человека
3.1.4. Влияние замены 3 в Мдомене
3.1.5. Геометрия петли
3.1.6. Динамика основной цепи Мдомена
3.2. Изучение взаимодействия между Мдомеиом человека и рибосомами эукариот
3.2.1. Определение способности Мдомена человека специфично связываться с субчастицами рибосом
3.2.2. Аминокислотные остатки Мдомена , формирующие интерфейс взаимодействия белка с субъединицами рибосомы
3.2.3. Влияние замены 3 на связывание Мдомена человека с субчастицами рибосом
3.3. Функциональная роль аминокислотных остатков минидомена
3.3.1. Анализ первичной структуры минидомена факторов терминации трансляции 1го класса
3.3.2. Связывание мутантных форм с предтерминационным комплексом и их способность вызывать коиформационные перестройки
3.3.3. Анализ активности мутантных форм
3.3.4. Возможный механизм гидролиза пептидилтРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы эукариот
ЗЛЗаключение ВЫВОДЫ БЛАГОДАРНОСТИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЛТФ аденозинтрифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
дтт дитиотрейтол
ед. акт. единица активности
мкг мпкрограмм
мкл микролигр
мкМ микромолярная концентрация
мМ милпмолярная концентрация
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ОКДЦВ остаточная константа дипольдипольного взаимодействия
птц пептидилтрансферазный центр
ПЦР полимеразная цепная реакция
РИК рибонуклеиновая кислота
РНКаза рибонуклеаза
рРНК рибосомная рибонуклеиновая кислота
ТЕМЕД КЫДЫтетраэтплепдиамид
тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота
ЭДТА этилендиаминтетрауксуспая кислота
ЯМР ядерный магнитный резонанс
ЯЭО ядерный эффект Оверхаузера
,ю оптическая плотность при 0 нм
УФ ультрафиолет
отт дитиотрейтол
аытр дезокоинуклеотидтрифосфат
ОТ5 гуанозинтрифосфат
ОЕР гуанозиндифосфат
СТРаза СТР гидролаза
РТС. изопропилтиорОгалактозид
РАДО п о л иакрн л а м идн ы й гел
РМБЕ фенилметансульфонплфторид
КЕ фактор герминацпи трансляции
додецилсульфат на трия
ВВЕДЕНИЕ


Ыдомен ответственен за узнавание стопкодонов матричной РНК. Сдомен взаимодействует с фактором терминации второго класса еИРЗ, за счет чего последний стимулирует активность еЯР1. Мдомсн содержит высококонсервативный трппептидный фрагмент СС3, необходимый для гидролиза пептидилтРНК как в эукариотах, так и в прокариотах. Результаты структурных и биохимических исследований указывают на то, чго минидомен СЮ5 располагается в пептидилтрансферазном центре большой субчастпцы рибосомы. Абсолютная консервативность ССрмотива в факторах терминации первого класса всех живых организмов указывает на его исключительную роль в процессе терминации трансляции. Полученная ранее структура . Поэтому исследования в данном направлении представляются актуальными. Целями данной работы являлись определение структуры высокого разрешения Мдомена еКР1 человека в растворе, изучение его динамических свойств, связывания Мдомена еКР1 с рибосомой эукариот и определение функциональной роли минидомена вОО в механизме терминации трансляции. Для определения структуры Мдомена еЯР1 нами был выбран метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса ЯМР, который в последние годы широко используется для определения структуры различных белковых молекул в растворе. Методы ЯМР позволяют также определить динамические свойства белка п исследовать его взаимодействие с другими биомолекулами. В задачи работы входило 1 получение высокоочищенных препаратов Мдомена еЯР1 человека, меченных стабильными изотопами С и Р1 2 получение меченого препарата мутантной формы Мдомена еЯР I С1у 3Л1а, неактивного в функциональных тестах 3 измерение и последующий анализ гетероядерных и спектров ЯМР для расчета структуры Мдомена и определения его динамических свойств 4 изучение взаимодействия Мдомена еЯР1 с рибосомами эукариот 5 выполнение точечных замен аминокислотных остатков в вврпетлс Мдомена еЯР1 методом сайтнаправленного мутагенеза 6 выделение, очистка и исследование функциональной активности полученных мутантных форм сЯР1 человека. В данной работе впервые определена структура высокого разрешения в растворе Мдомена еЯР1 человека и изучены его динамические свойства. С помощью методов ЯМР нами было исследовано взаимодействие Мдомена еКР1 с большой 8 субъединицей рибосомы эукариот, установлена его специфичность и идентифицированы аминокислотные остатки Мдомена, образующие возможный интерфейс такого взаимодействия. ССр. Полученные структурные и функциональные данные позволили впервые предложить модель механизма реакции гидролиза пептиднлтРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, в которой еИР1 служит непосредственным катализатором. Результаты представленной работы существенно углубляют понимание молекулярного механизма терминацни белкового синтеза трансляции у эукариот, что имеет важное значение для детального изучения процесса синтеза белка в эукариотической клетке в целом. Глава 1. Терминация трансляции, заключительная стадия биосинтеза пол и пептидной цепи, происходит в тот момент, когда в участке рибосомы оказывается один из трех стопкодонов транслируемой мРНК , или . В ответ на присутствие в сайте стопкодона с рибосомой связываются белковые факторы, получившие название факторов терминации трансляции . Они делятся на два класса. ПТЦ большой субчастицы и вызывают гидролиз пептидилтРНК, в результате чего синтезированный полипептид высвобождается из рибосомы. Общая схема терминации трансляции представлена на рисунке 1. После распознавания стопкодона 1го класса вызывают гидролиз сложноэфирной связи в пеитидилтРНК, что приводит к высвобождению синтезированного полипептида из рибосомы. У прокариот рис. Далее с 3 связывается , который вызывает конформационные изменения 3, в результате чего 1го класса диссоциируют из рибосомы. Затем происходит гидролиз и диссоциация самого 3 из рибосомы, после чего с ней связывается фактор рециклинга рибосом . Затем происходит связывание фактора элонгации в комплексе с и последующий гидролиз , приводящий к диссоциации малой и большой субчастиц рибосомы. Гидроям вТР. I Спяииие ЕРС, гидроли. СТР. Рис.