Структура CRO- репрессора бактериофага лямбда в растворе

• Автор: Курочкин, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. РЕПРЕССОРЫ с и СйбКОМПОНЕНТЫ РЕГУЛЯТОРНОЙ

СИСТЕМЫ БАКТЕРИОФАГА А

1.1. Молекулярный триггер в бактериофаге А .

1.2. Кристаллическая структура сгорепрессора

1.3. Структура нконцевого домена с1реирессора. Взаимодействие с ДЖ

ГЛАВА 2. ГОМОЛОГИИ. В СТРУКТУРАХ.РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ . .

ТРАНСКРИПЦИИ.

2.1. сАМРзависимый активатор кагаболитных
2.2. Обшие черты кристаллических структур
2.3. Аминокислотные последовательности и
вторичные структуры
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДО ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Материалы и реактивы
3.2. Выделение сгорепрессора
3.3. Определение характеристик белка.
3.4. КД и УФспектроскония
3.5. Спектроскопия ЯМР.
3.5.1. Приготовление образцов
3.5.2. Запись опектров. Методики.
3.6. Анализ кривых титрования
3.7. Измерение
ГЛАВА 4. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА СЙОРЕПРЕССОРА
4.1. Анализ аминокислотной последовательности.
4.2. Анализ данных КД
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ
ОСТАТКОВ И ВИУТРИМОЛ1ЖУШРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В СйОРЕПРЕССОРЕ
5.1. Исследование состояний остатков тирозина . .
с помощью абсорбционной спектроскопии
5.2. Изучение структуры сгорепрессора
методом ЯМР
5.2.1. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР
5.2.2. Изучение влияния ионизуемых групп.
Анализ кривых титрования.
5.2.3. Доступность растворителю
гистидина.
5.2.4. Идентификация внутримолекулярных взаимодействий с помощью ядерного,
эффекта Оверхаузера
ГЛАВА 6. СТРУКТУРА СйОРЕПРЕССОРА В РАСТВОРЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Примерно через три четверти часа после инфекции происходит лизис бактериальной клетки, и около 0 фаговых частиц выходит наружу 6. Вместе с бактериальной ДНК она реплицируетоя и передается дочерним клеткам как часть наследственного аппарата 7. В случае возникновения в ряде генов мутаций, препятствующих интеграции репрессированной фаговой ДНК, она переходит в состояние так называемой абортивной лизогении и передается одной из двух дочерних клеток при каждом клеточном делении 8. Профаг можно индуцировать с помощью разных агентов, общая особенность которых заключается в их разрушающем действии на ДНК клеткихозяина например, УФоблучение. Индукция профага, как и лизогения, может оказаться абортивной, когда после исключения фаговой ДНК из бактериальной хромосомы снова устанавливается репрессия II. При этом деление клетки не сопровождается репликацией циклизованной ДНК фага. В лизогенном состоянии выражается только ген с1, кодирующий с1репрессор, называемый также Арепрессором. Этот белок подавляет экспрессию всех остальных генов. Наоборот, при литическом развитии транскрипция гена с1 подавлена репрессором, кодируемым геном его, который регулирует также. Репрессоры с1 и его конкурируют между собой за связывание с тремя специфическими нуклеотидными последовательностями на операторе он. Конкурентное связывание приводит к одному из двух устойчивых состояний литическому или лизогенному 36, . Оба репрессора специфически связываются также с тремя сайтами на левом операторе оь . Но поскольку эта конкуренция не имеет решающего значения при выборе пути развития фага,мы не будем на ней останавливаться. Рассмотрим компоненты и функционирование этого молекулярного триггера. Оператор представляет собой часть ДНК фага длиной в пары оснований, расположенную между генами и его. В этой области находятся три сайта специфического связывания репрессоров 01, 2 и 3 по пар оснований каждый с промежутками спенсерами в 6 и 7 пар оснований между ними . Нуклеотидные последовательности этих сайтов сходны, хотя и не идентичны, и обладают выраженной центральной симметрией с осью второго порядка, проходящей через девятую пару оснований . i ii , направляющий транскрипцию репрессора И ранних генов фага, И i, направляющий транскрипцию влево от 0 ,. Первый из них перекрывается с 01 и 2, а второй с 03 ,. Такое взаимное расположение промоторов и операторных сайтов. Мономер с1репрессора представляет собой полипептид, состоящий из 6 аминокислотных остатков с молекулярным весом 8 . В его. Папаиновый гидролиз белка дает фрагменты 1 и 26, устойчивые к дальнейшему расщеплению и обладающие разными температурами плавления, что указывает на их относительную независимость в составе интактного репресеора . Доля остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот в белке составляет , и они распределены вдоль полипептидной цепи более или менее равномерно. ДНК. Несмотря на то, что активной формой белка является димер, изолированный концевой домен сохраняет способность связываться с ДНК, осуществляя те же контакты с операторными сайтами,что и интактный репрессор, а независимые Сконцевые домены могут димеризоваться ,. При этих концентрациях наблкщается также димеризация изолированных вконцевых доменов . Разумеется, i viv. Активность промоторов и Рш зависит от конкуренции. I. В профаге сайты 01 и 2 заняты с1репрессором, который, являясь как негативным, так и позитивным регулятором, блокирует транскрипцию с и стимулирует транскрипцию с рмй, поддерживая лизогенное состояние. В его отсутствие транскрипция с весьма неэффективна ,,, . На рис. РНКполимеразы на в состоянии лизогении. Помимо нуклеинбелковых контактов здесь имеют место взаимодействия между мономерами с1репрессора, между димерами, связанными с 01 и 2, и между димером с1репрессора на 2 и РНКполимеразой на РШ I0 М, но только димеры эффективно связываются с оператором ,, .