Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойств

• Автор: Воронова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Весенняя виремия карпа

1. Историческая справка

2. Предрасполагающие факторы, группы риска

3. Клиническая картина

4. Возбудитель заболевания вирус весенней виремии карпа

4.1. Структура вируса

4.2. Гликопротеин Обелок рабдовирусов

5. Существующие подходы к профилактике и лечению ВВК
И. Вакцинология в аквакультуре
1. Традиционные инактивированные и аттенуированные вакцины для рыб
2. Рекомбинантные технологии в аквакультуре
2.1. Субъединичныс вакцины для рыб
2.2. ДНКвакцины
2.2.1 .Опыт применения ДГКвакцин для рыб
2.2.2. Возможные системы доставки вакцины в организм рыбы
2.2.3. Исследование тканевого распределения плазмидной ДНК и продолжительности экспрессии рекомбинантног гена в организме рыб
2.2.4. Изучение механизмов представления АГ клеткам ИС
после введения ДНКваклин
2.2.5. Иммунный ответ
Гуморальный ИО рыб в ответ на ДНКвакцинацию
Тклеточный ИО у рыб на ДНКвакцины
Стимуляция врожденного ИО после введения ДНКвакцин
2.2.6. Исследование безопасности ДНКвакцин
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 .Реактивы
2.2.Ферменты
2.3. Олигонулеотиды
2.4.Плазмиды
2.5. Бактерии
2.6. Культуральные среды
2.7. Вирусы и клетки
2.9. Растворы
2.9. Методы
2.9.1. Выделение вирусной РНК
2.9.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК
2.9.3. Амплификация фрагментов ДНК
2.9.4. Элюция фрагментов ДНК
2.9.5. Коструирование рекомбинантных ДНК
2.9.6. Трансформация клеток . i плазмидной ДНК
2.9.7. Выделение плазмидной ДНК
2.9.8. Ферментативный гидролиз ДНК
2.9.9. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.9Анализ первичной структуры ДНК 2.9Электрофоретический анализ белка
2.9Получение иммунной сыворотки
2.9Иммуноферментный анализ
2.9Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками
2.9Приготовление препарата субъединичной вакцины для иммунизации 2.ценка протективности экспериментальных вакцин
2.9Оценка иммуногенности экспериментальных вакцин Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 .Генноинженерные плазмидные ДНК кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин вируса весенней виремии карпа американского изолята
3.1.1. Рекомбинантная конструкция
3.1.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК для
экспрессии гена гликопротеина вируса в Е.соИ субъединичная вакцина
3.1.3. Исследование продукции рекомбинантного вирусного гликопротеина в клетках Е. соИ
3.1.4. Иммуногенность экспериментальных вакцин
3.1.5. Защитные свойства экспериментальных вакцин
3.1.5.1. Эффективность экспериментальной ДНКвакцины
3.1.5.2. Эффективность субъединичной вакцины
3.1.6. Влияние изменения дозы вводимой плазмидной конструкции и неспецифических иммуностимуляторов на эффективность ДНКвакцинации
3.2.Генноинженерные плазмидные ДНК кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеип рефсрснсного для России изолята вируса весенней вирсмии карпа
3.2.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рсЭИА0ЗЛ4 кандидатной ДНКвакцины
3.2.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рВАСагрУахСЗЛ4 кандидатная ДНКвакцина
3.2.3. Продукция рекомбинантного вирусного гликоиротеина в культуре клеток
3.2.4. Защитные свойства вакцинкандидатов, кодирующих гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней вирсмии карпа
3.3. Генноинженерные плазмидные ДНК кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа
3.4. Влияние повышенной температуры воды и ридостина на эффективность ДНКвакцинации
Заключение
Список публикаций Благодарности Список литературы
Список сокращений
ВВК весенняя виремия карпа
белок гликопротеин
ИО иммунный ответ
АТ антитела
АГ антиген
ИС иммунная система
АПК антигенпрезентирующие клетки
ЦТЛ цитотоксические лимфоциты
МНС iiii x
ВГС вирусная вирус гемморагическая септицимия
ИНТГ инфекционный некроз гемопоэтичсской ткани
ИЗ индекс защиты
вм внутримышечное
вб внутрибрюшинное
ридостии
декстран диэтиламиноэтилдекстран
дезоксинуклеотидтрифосфат
М моль
мМ миллимоль
мкп микролитр
обмин оборотов в минуту
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
а.о. аминокислотный остаток
и.н. пара нуклеотидов
Введение


Более того, заболевание можно было воспроизвести, используя безбактериальные фильтраты, приготовленные из тканей пораженных рыб. На основании этих наблюдений другие исследователи полагали, что инфекционная водянка имеет вирусную природу. Тем не менее, несмотря на расхождение во взглядах, было признано существование двух форм заболевания острой асцитной и хронической язвенной. Возбудитель заболевания был впервые идентифицирован в году и назван вирусом весенней виремии карпа вирус ВВК, i vii vi, VV или vi i V. Хроническая форма была позднее названа эритродерматитом карпа. Со временем было показано, что возбудителем этого язвенного заболевания является неподвижная бактерия рода i . Помимо карпа к вирусу ВВК восприимчивы некоторые другие виды рыб белый и пестрый толстолобик, золотой карась, шайнер, линь, обыкновенный сом и белый амур i . В. , v I. Кроме того, имеется два сообщения о выделении рабдовируса vi i i, от больных гавайских креветок i i и . ВВК европейского изолята. Заболевание в этом случае приводило к значительной смертности среди инфицированных креветок . Во время вспышек ВВК обычно погибает около поголовья рыб, однако в тяжелых случаях смертность достигает . Было подсчитано, что потери среди годовиков карпа в гг XX века составляли ежегодно около тонн, т. При использовании для заселения водоемов двухгодовалых крапов, потери были более существенны i . Заболевание было диагностировано в странах с низкой температурой воды в прудах в зимний период Австрия, Босния и Герцеговина, Болгария, Хорватия, Чехия, Франция, Германия, Великобритания, Венгрия, Италия, Израиль, Польша, Румыния, Словакия, Испания, Югославия и некоторые страны бывшего Советского Союза. Серологические исследования сывороток крови карпов выявили вируснейтрализуюшие антитела АТ в рыбоводческих хозяйств Австрии, в Германии i , . Проведенные в последствии мероприятия по улучшению условий содержания и усилению контроля экспортируемой икры и рыбы, привели к значительному уменьшению числа вспышек V, а в большинстве регистрируемых случаев инфекция не имела явных клинических признаков. В результате, например, на некоторых рыбоводческих фермах Германии с серопозитивными карпами вспышки заболевания не регистрировались. Было установлено, что проявление болезни у рыб связано со стрессовыми факторами. Влияние их отмечают как в холодное время года в зимовальных прудах пересадка, угнетенные условия, антипаразитарпые обработки и др. При устранении всех вышеуказанных факторов болезнь не проявляется на протяжении многих лет даже в хозяйствах, ранее неблагополучных по ВВК. Однако в последние несколько лет в литературе появились сообщения о вспышках этого заболевания и выделении вируса ВВК в ранее благополучных районах с г. США i А. Е., , а в г. Китае i . В настоящее время имеет место тенденция к глобализации ВВК. По заключению экспертов, основным путем распространения болезни являются перевозки живой рыбы, в т. I, . Сезонность ВВК была известна исходно. Как и для большинства заболеваний рыб, температура воды является детерминирующим фактором в возникновении и исходе V. В экспериментальных условиях высокая смертность наблюдается на день при температуре С, и меньшая при С. Постепенное повышение температуры от до С ведет к более быстрому развитию симптоматики заболевания i . Заболевание не развивается у инфицированных рыб, содержащихся при С или выше. Метаболическая активность при такой температуре обеспечивает продукцию интерферона в первые сутки после заражения и АТ начиная с первой недели после инфицирования на достаточном для эффективной защиты уровне . Вспышки ВВК в естественных условиях отмечают в основном ранней весной при температуре в водоемах С, и в хозяйствах совпадают с пересадкой годовиков прудовых рыб из зимовальных прудов в нагульные. Болезнь продолжается ,5 месяца, затем, с повышением температуры воды в прудах до ПС, прекращается . Результаты этих исследований согласуются с наблюдениями, свидетельствующими о преобладании количества вспышек ВВК в весенний период.