Методические подходы к быстрому картированию сайтов расщепления генома

• Автор: Гайнетдинов, Ильдар Ваисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение. Метилирование ДНК и возможные его функции

1.1 Способы определения общего количества 5метилцитозина

1.2 Применение метилчувствителъных рестрикционных эндонуклеаз

1.3 Секвенирование по МаксамуГилберту

1.4 Бисулъфитное секвенирование

1.5 МБИаффинная колонка

Заключение

ГЛАВА И. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

2.1 Создание и оптимизация нового метода
2.2 Компьютерная автоматизация обработки
получаемых результатов и их картирования
2.2.1 Формирование списка всех нуклеотидных репрезентативных последовательностей, полученных в результате секвенирования конкапьиеров
2.2.2 Создание базы данных всех присутствующих в исследуемом локусе нуклеотидных фрагментов, фланкирующих сайты НраЛ,
которые можно картировать с помощью ЖЗСС
2.2.3 Картирование имеющихся нуклеотидных
фрагментов по базе исследуемого локуса
2.3 Подходы к функциональному анализу получаемых
результатов и их компьютерная реализация
2.3.1 Визуализация результатов картирования .
2.3.2 Нормализация и последующая визуализация
нормализованных результатов .
2.4 Получение распределения гипометилированных сайтов НраП в локусе й8СОХ7А1 хромосомы
для нормальной легочной ткани человека
ГЛАВА III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы
3.2. Методы
ВЫВОДЫ V. ,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможность наследования метилирования в ряду клеточных поколений по полуконссрвативному механизму i, обусловлена именно симметричностью метилируемой последовательности и осуществляется благодаря наличию в ядре особых ферментов ДНКметилтрансфераз , . Среди возможных функций метшшрования, нужно отмстить, в частности, его способность участвовать в регуляции экспрессии тканеспецифических генов, регуляции транскрипции в процессе эмбриогенеза, поддержании стабильности хромосомного набора, канцерогенезе. Изначально сведения о наличии в ДНК высших эукариот 5метилцитозина были получены в году Роллином Д. Хотчкиссом i, . Тогда, при фракционировании азотистых оснований и нуклеозидов, образующихся в результате гидролиза ДНК тимуса теленка соляной кислотой, ему удалось обнаружить аномальное основание, которое в силу сходства его спектра поглощения с цитозином было названо им эпицитозином, а позже химически идентифицировано как 5мстплцитозин. Для подобного качественного анализа нуклеиновых кислот Хотчкисс использовал метод бумажной хроматографии в нбутаноле. Почти одновременно очень схожий подход был предложен Эрнстом Вишером и Эрвином Чаргаффом Vi , . ДНК. Вслед за выше упомянутыми работами было предложено огромное количество различных модификаций метода хроматографического разделения азотистых оснований и их нуклеозтидных производных Vi . , . Все они. Также очень высокой чувствительностью обладает подход, включающий предварительное радиоактивное мсчснис ДНК i viv , , в то же время это резко снижает точность количественной оценки, изза возможного неравномерного включения метки . i. Позже в связи с развитием усовершенствованных модификаций хроматографических методов были предложены новые способы оценки содержания 5метнлцитозина в ДНК. Среди них можно упомянуть газожидкостную i , , ионообменную i, ,. ОФВЭЖХ, i, i,. I i ВЭЖХ смеси мононуклеотидов, получаемой в результате либо химического i , i . ДНК нуклсаза Р1, ДНКаза I, фосфодиэстераза яда змеи i . . Последний обладает преимуществом, заключающемся в том, что он не сопровождается химической деградацией нуклеотидов . . Чувствительность этого метода была увеличена до 0 фг 5мстилцитозина в пг смеси с нсмодифицированным основанием благодаря использованию массспектрометрнн для детекции нуклеотидов, а в комбинации с радиоактивным мечением дала возможность определить фракции метилцитозина в ДНК дрозофилы равные 0,0,1 , . Развитие техники капиллярного электрофоеза позволило создать подход, имеющий ряд преимуществ по сравнению с ВЭЖХ низкая стоимость, быстрота эксперимента, а также минимальное количество материала, требуемого для 3 . Получение смеси нуклеотидов из геномной ДНК может производиться как химическим, так и энзиматическим нуклеаза Р1 и щелочная фосфатаза способом. При этом химический гидролиз обычно сопровождается образованием сложных смесей полинуклеотидов и их производных,что снижает достоверность оценки. Примерно 0,5 модифицированного основания может быть обнаружено таким образом в 1 мкг ДНК , . . Для изучения метилирования ДНК применяли и фотометрические методы, основанные на тонких различиях спектров оснований и их производных. Vi . Акцепторная способность ДНК в реакции энзиматического метилирования i vi в присутствии меченого донора СНз3Н8аденозилметионина также позволяет оценивать степень метилирования ДНК i . I ДНК метилтрансфераза . Выше описанный подход применяют в большинстве случаев лишь для получения качественных и относительных количественных оценок тотального статуса метилирования ДНК. Дополнительное же использование внутреннего стандарта точного количества ДНК с известным статусом метилирования в сайтах, узнаваемых метилтрансферазой позволяет перейти от относительной к абсолютной количественной оценке .