Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11

• Автор: Вишневский, Александр Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Содержание

Список сокращений.

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая ценность работы.

Обзор литературы

Бактериофаг Т4

Продукт гена 9

Продукт гена .

Базальная пластинка бактериофага Т4.

Структурная реорганизация базальной пластинки при инфицировании.
Морфогенез базальной пластинки
Фолдинг белка
Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цени
Гипотеза нуклеации и роста
Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов
Фолдинг белка в клетке.
Пост и котрансляционный фолдинг.
Шапероиы
Роль рибосомы в котрансляциониом фолдинге
Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания.
Изучение фолдинга хвостового шипа бактериофага Р ii
Свойства хвостового шипа
Термолабильиые интермедиаты фолдинга и образование телец включения
Темнературочувствительные мутации, приводящие к нарушению фолдинга
Супрессорные мутации
Изучение рефолдинга белка i vi
Побочные интермедиаты и тельца включения, исследуемые i vi
Формирование нативного тримера из телец включения.
Фолдинг БХШ определяет температуру инфицирования фага.
Временные дисульфидные связи в протримере.
Изучение хвостового шипа с помощью моноклональных антител.
Различие между путями фолдинга i viv и i vi.
Сдомен необходим для тримеризации шипа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Бактериальные штаммы.
Среды для выращивания бактерий и бактериофагов.
Приготовление компетентных клеток
Трансформация компетентных клеток . i плазмидной ДИК.
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках . i 3.
Приготовление экстрактов клеток, содержащих рекомбинантные белки.
Амбермутанты фага Т4
Приготовление дефектных частиц фага Т4.
Комплементация i vi
Выделение и очистка рекомбинантных белков
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Имму1 юбл оттинг.
Г ел ьфил ьтрация5
Векторы для клонирования.
Конструирование плазмидных векторов
Выделение и очистка плазмидной ДНК.
Полимеразная цепная реакция
Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР
Клонирование фрагментов гена
Клонирование гена 9 для экспрессии мутанта 9.
Конструирование векторов для коэкспрсссии пг 9 и его делеционных вариантов Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с
заменами 2
Конструирование плазмидной конструкции для экспрессии мутанта с заменой
.
Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с
заменами в области 58.
Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов 1 с
заменами в области 35.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Комплементация дефектных частиц фага продуктами генов 9 и .
Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4.
Мутагенез концевого сегмента пг9
Мутант 9.
Коэкспрессия пг9 и его делеционного варианта
Коэкспрсссия пг9 и его делеционных вариантов , 7 и СД3.
Сконцевые делеционные мутанты пг9
Мутагенез 2 в молекуле пг9.
Супрессорный мутант пг9.
Изучение продукта гена бактериофага Т4
Получение делеционных фрагментов 1
Тримеризация делеционных фрагментов 1.
Биологическая активность делеционных фрагментов 1.
Образование комплексов пгЮ с делеционными фрагментами 1.
Локализация участка взаимодействия с 1в молекуле пгЮ
Мутагенез предполагаемых участков взаимодействия пг9 и 1 с хвостовыми
фибриллами
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Функциональная роль домена пг9.
Роль Сдомена пг9
Свойства 1.
Заключение.
Список литературы


Механистическое представление процесса инфицирования и полученные структурные данные явились основой для проведения направленного мутагенеза отдельных генов с целью более глубокого понимания принципов и уточнения деталей функционирования машины инфицирования фага Т4. Настоящая работа посвящена изучению продуктов генов пг 9 и структурных белков базальной пластинки, прикрепляющих к ней длинные и короткие хвостовые фибриллы, соответственно. Пг9 играет ключевую роль в инициации процесса инфицирования передает сигнал с длинных хвостовых фибрилл на белки базальной пластинки, приводя к е структурной реорганизации. Кроме того, пг9 и пг являются хорошими моделями для изучения фолдинга и олигомеризации сложных многодоменных белков. Выяснение принципов укладки полипептидных цепей в нативную пространственную структуру является одной из самых актуальных проблем молекулярной биологии и имеет важное практическое значение для биотехнологии и медицины. Целью настоящей работы явилось выяснение роли отдельных доменов пг9 и пг в механизме инфицирования бактериофага Т4. Получить делеционные варианты пг, а также мутанты пг9 с заменами отдельных аминокислотных остатков. Изучить свойства точечных мугантов и различных Ыконцевых и Сконцевых делеционных вариантов пг9 и пг. Сконструировать векторы для коэкспрессии полноразмерного пг9 и его делеционных вариантов с удалнным Иконисвым сегментом, 4 ЫМ и Сдоменами. Изучить свойства продуктов коэкспрсссии. Провести мутагенез предполагаемых областей взаимодействия пг9 и пг с фибриллами. В настоящей работе показано, что белок базальной пластинки фага Т4 пг9 встраивается в нее своим Мдомсном. Доказано, что для передачи сигнала на базальную пластинку в процессе инфицирования важна интактность Идомена пг9. Получены дополнительные доказательства того, что Сдомен ответственен за тримеризацию пг9. Показано, что тримеризация иг9, скорее всего, происходит посттрансляциошю. Сконцевые аминокислотные остатки в1п2, 13 и Ие4 играют важную роль в стабилизации тримера белка. Впервые для пг9 были полнены темиературочувствительные мутации . Более того, выявлена мутация, супрессирующая температурочувствительный эффект мутаций. Для пг 1, в отличие от пг9, первые аминокислотных остатков а. конца не влияют на олигомеризацию и функциональную активность белка. Однако более протяжнные делеции, вплоть до полного удаления концевого домена, хоть и не влияют на способность белков к тримеризации, приводят к потере их биологической активности за счт существенного нарушения структуры. Было показано, что концевая область тримера пг взаимодействует с центральной областью тримера пгЮ i vi. Возможно, именно с этого взаимодействия двух белков начинается сборка базальной пластинки в процессе морфогенеза частицы фага Т4 i viv. Полученные результаты позволяют дополнить существующие на сегодняшний день представления о механизме инфицирования бактериофага Т4. Бактериофаг Т4 ii i является хорошей моделью молекулярной биологии и широко используется при изучении механизмов, контролирующих сборку и морфогенез биологических структур , i . Фаг 4 обладает одним из самых сложно устроенных вирионов и состоит из капсида длиной и шириной 0 с геномной ДНК, сократимого хвоста длиною ЮООА и диаметром 0 и базальной пластинки, к которой прикреплены хвостовые фибриллы рис. Геном этого фага имеет размер пар оснований п. РНК, и как минимум два гена, кодирующих небольшие II с неизвестными функциями i , . Бактериофаг Т4 обладает эффективностью инфицирования равной 1, скорее всего за счт сложной структуры аппарата инфицирования хвоста и базальной пластинки, к которой присоединены длинные и короткие хвостовые фибриллы. Коннекторами длинных и коротких хвостовых фибрилл являются продукты генов 9 и И, соответственно. Пг9 и являются удобными экспериментальными моделями для изучения фолдинга и олигомеризации сложных многодоменных белков, одной из важнейших фундаментальных проблем клеточной биологии, которая имеет принципиальное значение для развития белковой инженерии и биотехнологии.