Поиск и изучение транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гомеобоксного гена Xanf-1 в развитии головного мозга у шпорцевой лягушки

• Автор: Мартынова, Наталья Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Введение.

1. Литературный обзор

1.1 Нейральные индукторы и антинейрогенные факторы

1.2 Регионализация нервной трубки

1.3 Транскрипционные факторы, принимающие участие в ранней дорсовентральной регионализации нервной пластинки.

1.4 Антериорнопостериорная регионализация нервной пластинки.

1.5 Факторы, которые могут играть роль постеризующего сигнала

в формировании ранней АП разметке нервной пластинки

1.6 Роль вертикальной и планарной индукции в разметке

нервной пластинки

1.7 Пространственная модель АП разметки нервной пластинки

1.8 Роль гомеобоксного гена ХапГ 1 в раннем развитии переднего
мозга у позвоночных
1.9 Прицельный поиск транскрипционных регуляторов эмбриогенеза при помощи дрожжевойодногибридной системы.
2. Результаты и их обсуждения
Подходы и модели, использованные в работе.
2.1 Поиск транскрипционных регуляторов гомеобоксного гена X.
2.1.1 Скрининг экспрессионной кДНК библиотеки поздней гаструлы шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой одногибридиой системы
2.1.2 Краткая характеристика идентифицированных транскрипционных факторов и анализ расположения их зон
экспрессии по отношению к зоне экспрессии X1.
2.2 Изучение роли транскрипционных факторов x4ivi
и Xv2 в локализации экспрессии X1 в головной нейроэктодерме.
2. 2.1 Проверка способности белковых факторов x4ivi
и Xv2 связываться с регуляторным элементом промотора
гена X1 i vi.
2.2.2 Анализ влияния экзогенных факторов x4ivi
и Xv2 на экспрессию гена X1 в эмбрионах шпорцевой лягушки.
2.2.3 Проверка ингибирующего действия эндогенных
факторов x4ivi и Xv2 на ген X1.
2.2.4 Проверка гипотезы о непосредственном воздействии транскрипционных рспрессоров x4ivi и Xv2 на экспрессию гена X
2.2.5 Подавление экспрессии гена X1 в туловищной зоне нервной пластинки хорошо согласуется с активационнотрансформационной моделью нейральной индукции.
Выводы.
3. Экспериментальная часть
3.1.1. Реактивы.
3.1.2. Ферменты.
3.1.3. Лабораторное оборудование
3.1.4. Лабораторные животные
3.1.5. Буферы и растворы
3.1.6. Микробиологические среды.
3.1.7. Предоставленные плазмиды.
3.1.8. Предоставленные iзонды
3.2. Методы исследования
3.2.1 Дрожжевая одногибридная система
3.2.2 Метод торможения в геле ДНКбелковых комплексовЕМ8А.
3.2.3 Методы, использованные для приготовления ДНКконструкций
3.2.4. Приготовление конструкций для синтеза мРНК для микроинъекций .
3.2.5 Транскрипция i vi.
3.2.6. Получение зародышей шпорцевой лягушки.
Микроинъекции синтетических мРНК в зародыши шпорцевой лягушки
3.2.7. Блокирование экспрессии генов на уровне подавления
трансляции эндогенной мРНК при помощи микроинъекций антисмысловых Морфолино Олигонуклеотидов МО.
3.2.8. Синтез iмеченых гибридизационных зондов.
3.2.9. Фиксация зародышей.
3.2 Гибридизация I i
Список сокращений.
Благодарности.
Список литературы


В связи с этим, актуальной задачей является поиск и изучение функций специфических транскрипционных факторов, обеспечивающих строгую пространственную локализацию экспрессии Хап1 в границах будущего зачатка переднего мозга. Поскольку решение данной задачи сопряжено со значительными трудностями, обусловленными, прежде всего, малыми размерами раннего зачатка переднего мозга и, как следствие, весьма низкой копийностыо искомых транскрипционных факторов, актуальной технической задачей является разработка методики, позволяющей проводить систематический поиск таких факторов с помощью экспрессионных кДНК библиотек эмбриональных клеток. Решение этих двух задач представляется важным не только для выяснения механизмов, контролирующих экспрессию одного из ключевых регуляторов дифференцировки переднего мозга, гена Хап1У но и с точки зрения разработки универсальных подходов к изучению механизмов регуляции экспрессии генов в индивидуальном развитии. Глава 1. Нейральные индукторы и антииейрогенные факторы. Закладка центральной нервной системы ЦНС у позвоночных животных происходит в период гаструляциинейруляции, когда дорсальная эктодерма эмбриона детерминируется к развитию в зачаток ЦНС под воздействием индукционных сигналов, исходящих из т. Впервые явление нейральной индукции было продемонстрировано немецким исследователем Г. Шпеманом на эмбрионах тритона, у которых пересадка дорсальной губы бластопора от зародышадонора на вентральную сторону зародышарецепиента индуцировала у последнего развитие второй ЦНС. Впоследствии, область дорсальной губы бластопора, проявляющая подобные свойства индуктора получила название Шпемановского или первичного эмбрионального организатора, а само явление было названо первичной эмбриональной индукцией. В дальнейшем аналоги Шпемановского организатора и явление нейральной индукции были обнаружены так же и у позвоночных других классов. Появление этих сигнальных молекул вызывает формирование дорсальной мезодермы и Шпемановского организатора i, , , который, в свою очередь, на стадии гаструлы запускает каскад сигналов, приводящий к индукции и регионализации всей экзодермы . Индукцию нервной ткани из эктодермы под действием организатора традиционно принято называть первичной индукцией. Долгое время идентификация факторов, вызывающих первичную индукцию была значительно затруднена в связи с малым количеством биологического материала и сложностью выделения выделением таких неустойчивых и короткоживущих факторов. Только в г. Шпсмановского организатора и способны индуцировать дифференцировку нервной ткани из эмбриональной эктодермы зародыша шпорцевой лягушки. Белковые факторы i i , . РНК, кодирующие эти белки, в клетки изолированной эктодермы. Кроме того, белки i и i способны индуцировать в вентральной мезодерме развитие скелетной мускулатуры, т. Эти данные позволяют предположить, что роль сигнальных молекул для нейральной индукции и сигналов, дорсализующих мезодерму, могут играть одни и те же факторы, а специфичность ответа зависит от природы тканимишени. Обратные эффекты были выявлены при изучении ВМР4, белка из семейства . Так, было установлено, что ВМР4 способен вызывать вентрализацию мезодермы . Напротив, в случае блокирования эндогенного белкового фактора ВМР4 с использованием доминантнонегативного рецептора или антисмысловой РНК, препятствующей трансляции эндогенной ВМР4 мРНК, клетки эктодермы развиваются в нервную ткань даже в отсутствии нейральных индукторов i . X . В начале гаструляции ген ВМР4, а так же его гомологи ВМР2 и ВМР7 экспрессируются в эмбрионах шпорцевой лягушки по всей эктодерме, однако, по ходу нейральной индукции, его экспрессия прекращается в клетках будущего нейрального зачатка i . Интересно, что гомологи 4 i и i i были выявлены у дрозофилы. При этом было показано, что у дрозофилы эти факторы играют ту же роль нейрогенную и антинейрогенную соответственно, что и у позвоночных . Более того, оказалось, что человеческий фактор ВМР4 может восстанавливать нормальный фенотип у мух, мутантных по гену . Аналогично, белок проявлял вентрализующую активность в эмрионах X .