Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции

• Автор: Бабкина, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 148 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.

2.1 Уникальные методы генотипирования РНКсодержащих вирусов

2.1.1. Олигонуклеотидный метод отпечатков пальцев.

2.1.2. Анализ полиморфизма длин геномных сегментов. Электрофоретипирование

2.2. Методы генотипирования ДНК и РНКсодержащих вирусов.

2.2.1. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот.

2.2.2. Иммуноферментный анализ ДНК

2.2.3. Анализ с помощью РНКазы А

2.2.4. Гетеродуплексный анализ

2.2.4.1. Анализ подвижности гетеродуплексов.

2.2.4.2. Анализ подвижности гетеродуплексов с меченым зондом
2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК
2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПДРФ
2.2.6.1. Классический ПДРФ анализ.
2.2.6.2. ПЦРПДРФ анализ
2.2.6.3. ОТПЦРПДРФ анализ.
2.2.6.4. ДПЦРПДРФ анализ.
2.2.6.5. Филогенетический анализ данных ПДРФ
2.2.6.6. Саузернблот анализ
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности вирусных геномов.
2.2.7.1. Методы секвенирования
Стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК
Применение секвенирования для генотипирования вирусов
2.2.8. Генотипирование смешанных инфекций.
2.3. Генотипирование поксвирусов
2.3.1. ПДРФ анализ ДНК ортопоксвирусов
2.3.2. ПЦРПДРФ анализ ортопоксвирусов
2.3.3. ПЦР методы анализа ДНК ортопоксвирусов.
2.3.4. Методы молекулярной гибридизации ортопоксвирусов.
2.3.5. ПДРФ анализ ДНК поксвирусов
2.3.6. Определение нуклеотидных последовательностей поксвирусов
2.4. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы.
3.2. Выделение ДНК вируса натуральной оспы.
3.2.1. Выделение ДНК вируса натуральной оспы, культивированного в культуре клеток Уего.
3.2.2. Выделение ДНК вируса натуральной оспы, культивированного на ХАО КЭ
3.3. Олигонуклеотидные праймеры для ДГ1ЦР
3.3.1. Олигонуклеотидные праймеры для получения музеев ампликонов и клонотек фрагментов ДНК ВНО.
3.3.2. Олигонуклеотидные праймеры для ПДРФДПЦР анализа
3.4. Длинная полимеразная цепная реакция ДПЦР
3.5. Получение рекомбинантных плазмид
3.6. Приготовление компетентных клеток Е.соИ.
3.7. Трансформация компетентных клеток Е.соИ.
3.8. Выделение плазмидной ДНК
3.9. ДПЦРПДРФ анализ
3 Филогенегический анализ данных ДПЦРПДРФ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Получение и характеризация препаратов полноразмерных ДНК ВНО
4.2. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО
4.2.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР.
4.2.2. Получение и характеризация коллекций ампликонов ДНК ВНО.
4.2.3. Создание музея коллекций ампликонов ДНК ВНО.
4.3. Создание клонотек фрагментов ДНК полных геномов штаммов вируса натуральной оспы.
4.3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР.
4.3.2. Синтез ампликонов ДНК ВНО для получения рекомбинантных плазмид
4.3.3. Получение рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО
4.3.4. Создание музея клонотек фрагментов ДНК ВНО
4.4. Изучение вариабельности геномов разных штаммов ВНО при использовании ДПЦРПДРФ анашза
4.4.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР.
4.4.2. Получение ампликонов для ДПЦРПДРФ анализа Российской коллекции ДНК
4.4.3. Получение рестрикционных профилей ампликонов.
4.4.4. Филогенетический анализ ДПЦРПДРФ базы данных штаммов ВНО Российской коллекции.
4.4.5. Филогенетическое сравнение геномов штаммов ВНО Российской коллекции и коллекции США.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЕ
8. ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


ДПЦРПДРФ анализ сорока пяти штаммов ВНО из коллекции США выполнен Ю Ли при участии автора. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США проведен автором совместно с И. В. Бабкиным. В последние годы все острее встает проблема возникновения новых вирусных заболеваний. СПИД, синдром атипичной пневмонии, лихорадка Эбола, птичий грипп являются угрозами для всего человеческого сообщества. В случае ортопоксвирусов обращают на себя внимание вспышки оспы обезьян в Демократической Республике Конго, начавшиеся в гг. При этом процент заболевших в результате передачи инфекции от человека к человеку до г. В году этот показатель увеличился в 2,5 раза и составил . Возросло в 2 раза и число генераций в цепи передачи инфекции от человека к человеку. Выявившиеся факты привели к пересмотру представлений о вирусе оспы обезьян как о малоконтагиозной инфекции, не представляющей интереса для общественного здравоохранения МикЫа е л. НШш еа. В связи с вышесказанным очень важно исследовать изменчивость и эволюционные взаимосвязи вирусов. Современные методы типирования вирусов подразделяют на фенои генотипические. Фенотипические методы это методы, с помощью которых определяются характеристики, проявляемые вирусом. Генотипические это методы исследования структуры полноразмерных геномов или их фрагментов Ве1киш, Шагинян, . Классические вирусологические методы изучение размножения вируса на восприимчивых животных, в псрмиссивных культурах клеток или на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов. Серологические методы, основанные на взаимодействии антигена с антителом реакция связывания комплемента, реакции пассивной и обратной гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации, реакция агглютинации сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов, метод иммунофлуоресценции, а также различные варианты иммуноферментного анализа. Морфологические методы типирования электронная и иммунная электронная микроскопии. Для этой цели необходимо использовать генотипические молекулярные методы, выявляющие различия в структуре вирусных геномов табл. Вирусные геномы могут мутировать, при этом сохраняются существенные характеристики их белков и вирионов. Эта изменчивость основа для молекулярной характеризации и классификации типов вирусов. Некоторые области вирусного генома чрезвычайно консервативны, в то время как другие области могут быть гипервариабельными. Если изучается только фрагмент генома, необходимо подходить к его выбору с большим вниманием. Структура тестируемого фрагмента должна представлять собой вариабельную последовательность, фланкированную консервативными участками. Это позволяет проводить амплификацию последовательности с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР и типировать всех представителей вида по результатам анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПДРФ или определения нуклеотидной последовательности , Орешкова, . Замены нуклеотидных оснований н. Отдельные замены н. Необходимо отметить, что РНКсодержащие вирусы имеют намного более высокую скорость мутационных изменений, чем ДНКсодержащие вирусы, вследствие того, что вирусные РНКзависимые РНКполимеразы не могут редактировать ошибки, сделанные во время репликации генома , . Олигонуклсотидный метод отпечатков пальцев для исследования геномов РНКсодержащих вирусов был впервые описан i . В методе используется гидролиз радиоактивномеченой геномной РНК с помощью РНКазы Т1, эндонуклеазы, выделенной от i . Эта РНКаза расщепляет одноцепочечную РНК с 3 конца остатков гуанидина. Далее проводят двумерный электрофорез сначала в 8ом полиакриламидном геле с 6М мочевиной при 4С в первом направлении, затем в ом полиакриламидном геле в трисборатном буфере при комнатной температуре во втором направлении после поворота от первого направления. Рмеченые РНКфрагменты распределяются согласно их размеру и составу и выявляются авторадиографией как множество пятен i, . II Таб. Молекулярияи тибридизяимя Не д. ИммуиофермемтныА анализ днк Нет П осл еоовате.