Структурно-функциональный анализ ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7

• Автор: Туницкая, Вера Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 260 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физикохимические свойства Т7РНКП, первичная

и пространственная структура фермента

1.2. Транскрипционный цикл Т7РНКП

1.2.1. Взаимодействие с промотором.

1.2.2. Связывание КГР и инициация транскрипции.

1.2.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК.

1.2.4. Неспецифические проявления активности Т7РНКЛ.

Беспромоторныс системы.
1.2.5. Терминация транскрипции.
. Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных
аминокислотных остатков
1.2.5. Химическая модификация и ингибиторный анализ.
1.2.6. Аффинная модификация
1.2.7. Исследование мутантных форм Т7РНКП
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы, буферные растворы, плазмиды и ферментные препараты
2.2. Методики, использованные в работе.
2.3. Расчет кинетических параметров реакций.
2.4. Конформационные расчеты и построение пространственных моделей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Аналоги нуклеотидов субстраты и ингибиторы Т7РНКП
3.2. Необратимые ингибиторы Т7РНКП. Аффинная модификация фермента
. Роль концевого домена и междоменной перемычки.
3.3.1.Изучение ограниченного протеолиза Т7РНКП
3.3.2. Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки
3.3.3. Мутации по остатку
3.4. Роль аминокислотной последовательности 31 в Т7РНКП
3.5. Исследование консервативного мотива В
3.5.1.Общая характеристика мотива В.
3.5.2. Обоснование выбора вариантов аминокислотных замен
3.5.3. Мутации в концевой части мотива В
3.5.4. Мутации в Сконцевой части мотива В
3.6. Уникальные свойства мутанта 9. Двойной и тройной мутанты
3.6.1 .Утилизация дезоксирибонуклеотидов мутантной формой Т7РНКП
3.6.2. Ошибки при транскрипции, свойственные двойному и тройному мутантам
3.6.3. Функционирование двойного мутанта Т7РНКП в режиме
удлинения праймера
3.7. Взаимодействие Т7РНКП с модифицированными промоторами
3.8. Фотоаффинная модификация Т7РНКП. 53Е4азидо2Д,6
тстрафторбензамидопропенил11ЛГР зТГВРЦТР
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Существует мнение, что сила промотора коррелирует со степенью совпадения с консенсусной структурой 2,, однако эта закономерность не является абсолютной. Все промоторы имеют строго консервативных позиций, располагающихся на участке 1. Однако большинство известных промоторов все же содержат отличия от консенсусной последовательности на 27 оснований, причем преимущественно в области считывания, т. Таким образом, предъявление строгих требований к последовательности считываемой части представляется не столь убедительным. Помимо того, что она не соблюдается для части нативных промоторов, при использовании Т7РНКП в эксперименте как инструмента для синтеза различных РНК, эта последовательность искусственно изменялась многими исследователями. Единственным необходимым условием является наличие первого инициирующего остатка ОТР. Это условие ранее рассматривалось как спорное, поскольку два консенсусных Т7 промотора рО АТР. Однако недавняя работа i позволила снять это противоречие было показано, что синтез РНК в этих случаях начинается с положения 2 матрицы. Достаточно высокая эффективность синтеза отмечается в случае, если синтезируемая РНК начинается с трех, в крайнем случае с двух, остатков в положениях 4 6 предпочтительнее оказываются пуриновые нуклеотиды, но их последовательность не имеет значения. Имеется целый ряд широко используемых рекомбинантных плазмид, содержащих Т7промотор, которые различаются последовательностью после 3 нуклеотидной пары, например плазмиды серии содержат последовательность . При этом в большинстве случаев ни эффективность, ни кинетические параметры реакции с этих промоторов i vi существенно не различаются. Максимовой и соавт. пиримидиновое основание в позиции 2, хотя эффективность синтеза была невелика. Исходя из этого, строго детерминированной, повидимому, следует считать лишь последовательность промотора 2. Пространственное расположение промотора. Контакты с ферментом. Необходимая протяженность промоторного участка. Взаимное расположение Т7РНКП и ее промотора, ДНКбелковые контакты и конкретные аминокислотные и нуклеотидные остатки, непосредственно вовлеченные в процесс связывания, были предметом многочисленных исследований в течение ряда лет. При этом использовались разнообразные методы, включая футпринтинг, химическую модификацию, различные физикохимические и оптические исследования, изучение связывания многообразных мутантных и модифицированных форм промотора и т. Наиболее информативными оказались результаты РСА бинарного комплекса ферментпромотор, публикация которых позволила расставить некоторые точки в этом вопросе см. Существует противоречивая информация относительно важности характера последовательности нуклеотидов выше положения , и самого наличия такой последовательности. В работе v показано, что натичие в положениях и остатков соответственно и увеличивает скорость ферментативной реакции в 5 раз. Однако, по данным этой же работы, дальнейшее удлинение матричной ДНК в сторону удаления от консенсусной последовательности до положений и , вопервых, имело следствием обратное снижение активности фермента вовторых, в этих случаях наличие остатков и в положениях и переставало оказывать скольконибудь существенный эффект втретьих, величина наблюдаемых различий существенно варьировала в зависимости от времени протекания реакции, чего авторы работы никак не объясняют. i установили, что олигонуклеотиды, представляющие консенсусную последовательность промотора вплоть до позиций как , так и , и обеспечивающие синтез коротких пентануклеотидов, одинаково эффективно используются Т7РНКП. В то же время укорочение промотора слева до положения существенно ухудшает связывание, а сокращение последовательности до полностью инактивирует промотор . Эксперименты I i по футпринтингу комплекса Т7 РНКПпромотор с использованием метидиумпропилЭДТА I , показали, что фермент защищает на обеих цепях ДНК участок от до 3 положения.