Белки теплового шока микоплазм : Клонирование и экспрессия гена dnak

• Автор: Вонский, Максим Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 121 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования.

Научная новизна полученных результатов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Филогения и таксономия микоплазм

1.2. Размер и особенности нуклеотидного состава генома микоплазм

1.3. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов микоплазм

1.4. Структурная организация геномов микоплазм

1.5. Открытые рамки считывания в геноме микоплазм и особенности метаболизма
1.6. Проблемы интерпретации ОРС.
1.7. Рекомбинация как источник вариабельности генов
микоплазм.
1.8. Повторяющиеся последовательности ДНК микоплазм.
1.9. Экстрахромосомные ДНК
1 Геном микоплазм и минимальный геном бактериальной
1 Структура белков семейства кДа БТШ эукариот и прокариот
1 Механизм действия шаперонов семейства кДа БТШ.
1 Модуляция активности ЭпаК кошаперонами Опа и вгрЕ
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Штаммы и условия культивирования
2.2. Индукция синтеза БТШ у микоплазм и импульсное
введение метки.
2.3. Иммуноблоттинг
2.4. Выделение ДНК и клонирование
2.5. Полимеразная цепная реакция.
2.6. Отбор рекомбинантных фагов или плазмид
2.7. Сиквенс.
2.8. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных
поел едовател ы юсте й.
Глава 3. Результаты
3.1. Экспрессия БТШ у микоплазм
3.2. Идентификация основных БТШ микоплазмы.
3.3. Амплификация фрагментов гена с1паК микоплазм разных видов.
3.4. Клонирование и сиквенс гена спаК А.ШсИамгИ.
Глава 4. Обсуждение
4.1. Микоплазмы разных видов различаются но способности к индукции синтеза и накоплению ЭпаК.
4.2. Анализ нуклеотидной последовательности участка хромосомы АЛаШамп, кодирующей ген спаК
4.3. Реконструкция филогенетического древа, основанного на
последовательностях ЭпаК.
Выводы.
Список литературы


В качестве организмахозяина микоплазм выступают млекопитающие, птицы, рыбы, растения, и насекомые. Несмотря на отсутствие клеточной стенки и примитивность организации, микоплазмы являются весьма успешными паразитами. Результаты анализа последовательности I6 рРНК позволяют заключить, что микоплазмы не относятся к примитивным бактериям со слабо развитыми метаболитическими путями. Предполагаю i . , . Исходя из этого, предполагают, чго основные молекулярнобиологические процессы репликация, регуляция экспрессии, транскрипция и др. В тоже время показано, что микоплазмы являются быстро эволюционирующими, тахителичными организмами, повышенная скорость мутирования которых не может не привести к появлению и накоплению особенностей в молекулярной организации x . Двумя необычными особенностями, характеризующими геном микоплазм, являются его размер и нуклеотидный состав. Микоплазмы обладают геномом наименьших размеров, известных для микроорганизмов, способных к самостоятельному воспроизведению. Так, геном . ii . Кроме того, геном микогшазм отличается крайне низким содержанием , составляющим для некоторых видов всего молярных , . В процессе эволюции, адаптировавшись к паразитическому образу жизни в физиологически стабильных условиях, микоплазмы лишились целого ряда метаболитических путей, характерных для большинства бактерий и редуцировали значительную часть генетического аппарата. Жизнедеятельность типичной бактериальной клетки, подобной . А и сукцинилкоэнзима i . Общее число типов метаболитических реакций, обнаруженных или предполагаемых, у микоплазм не превышает 0, причем в них синтезируются или используются только основных метаболитов . У микоплазм отсутствуют пути синтеза компонентов клеточной стенки, пути синтеза v аминокислот и пуринов, жирных кислот, функциональный цикл трикарбоновых кислот, цитохромы и соответствующий электронный каскад i, i, . . . Количество оперонов в геноме микоплазм также ограничено. Большинство микоплазм имеют одну копию и только некоторые виды микоплазм содержат в хромосоме два оперона генов i, . Можно предположить, что система ответа на тепловой шок у микоплазм также подверглась редукции. Вероятно, микоплазмы обладают ограниченным набором белков теплового шока БТШ, регуляция экспрессии которых также может быть упрощена. iii единственная из микоплазм, встречающаяся в природе в отсутствие организмахозяина. Вследствие своего независимого существования, клетки . Изучение системы синтеза БТШ у микоплазм, рассматриваемых в качестве естественной модели минимальной клетки, важно для понимания фундаментальных основ защиты клетки от теплового шока. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей поможет уточнить особенности , обусловленные редуктивной эволюции микоплазм. РНК. Цель настоящей работы состояла в исследовании ответа на тепловой шок микоплазм разных видов, выявлении основных белков теплового шока микоплазм, клонировании и изучении особенностей молекулярной организации гена и белка ОпаК. А1тссмп. Исследовать ответ на тепловой шок у микоплазм. Выявить и охарактеризовать экспрессию основных БТШ у микоплазм разных видов. Показать присутствие нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену сФюК, у микогшазм разных видов. Клонировать ген спаК микоплазмы А. ШсЦсми. Провести анализ нуклеотидной последовательности гена с К А. ШсИсми, выявить особенности организации белка ПпаК у микоплазм. На основе известных аминокислотных последовательностей ОпаК ряда микроорганизмов реконструировать филогенетическое древо и сравнить его с имеющимися версиями филогенетических древ, построенных на основе первичных структур генов Б рРНК, устанавливающих отношения микоплазм с другими микроорганизмами. Научная новизна полученных результатов. В работе впервые показана экспрессия БТШ у микоплазм. Выявлено, что микоплазмы различаются по способности к индукции синтеза БТШ в ответ на тепловой шок. Показано, что А.