Молекулярные механизмы, ограничивающие пролиферативный эффект индивидуальных факторов роста одним клеточным циклом

• Автор: Андреева, Виктория Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

1.Клеточный цикл

1.1 Универсальная теория клеточного цикла

1.2 Белковые регуляторы клеточного цикла

1.2.1 Белки семейства Шэ

1.2.2 Комплексы С1кциклин в середине периода

1.2.3 Комплексы С1кциклин в позднем периоде

1.2.4 Комплексы С1кциклин в Б и фазах

1.2.5 Семейство Сс1к ингибиторов 1ЫК

1.2.6 Семейство С1к ингибиторов С1РК1Р

2. Факторы роста

2.1. Факторы роста фибробластов

2.1.1. Структура, регуляция синтеза и внутриклеточная локализация
2.1.2. Рецепторы РОБ и НБРО
2.2. Тромбоцитарный фактор роста
2.2.1. Структура и регуляция биосинтеза РЭОБ
2.2.2. Семейство рецепторов РОСБ
2.3. Сыворотка крови
2.4. Активация тирозинкиназных рецепторов факторами роста
3. Пролиферативное старение и покой
3.1. Пролиферативный покой
3.2. Пролиферативное старение МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры и условия культивирования клеток Перевод клеток в состояние пролиферативного покоя Факторы роста
Приготовление радноавтографнчсских препаратов
Анализ препаратов, меченных 3Нтимидино.м
Построение кривых роста
Получение белковых лизатов
Иммунопреципитация
Иммуиоблотгинг
Определение киназной активности комплекса Ск2циклин Е
Иммуноистощение р и р
Выделение РНК и Норзсрп блот
Инфекция клеток i ЗТЗ аденовирусом, кодирующим циклин А или
Получение клонов, экспрессирующих антисмысловую РНК р
Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Проточная цитометрня
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Пролиферативный эффект 1 и на клетки i ЗТЗ
2. Определение способности клеток i ЗТЗ проходить более одного клеточного цикла при их стимуляции 1 и
3. Динамика вступления в репликацию клеток i ЗТЗ, стимулированных сывороткой после длительной стимуляциии 1
4. Митогенный ответ клеток i ЗТЗ на сыворотку после длительной стимуляции 1 и
5. Молекулярнобиологическое исследование пролиферативного состояния клеток, находящихся в первом и во втором клеточном
циклах после их стимуляции 1 и
5.1 Уровень фосфорилирования рецепторов и
5.2 Уровень фосфорилирования МАРК
5.3 Сравнение экспрессии генов раннего и задержанного ответа
5.4 Экспрессия циклинов и циклинзависимых киназ
5.5 Экспрессия ингибиторов
5.6 Уровень циклинов в стареющей культуре V
6. Сравнение митогенного ответа па факторы роста в стареющих культурах фибробластов мышей 1 и 1
7. Искуствсипая экспрессия циклина А не вызывает вступления во второй клеточный цикл клеток i ЗТЗ, стимулированных 1
8. Внутриклеточное распределение р и р в клетках i ЗТЗ, стимулированных 1, или сывороткой
9. В клетках, стимулированных 1 и , р и р связаны с комплексом Ск2цикшш Е во втором клеточном цикле
. Снижение активности комплекса Сс1к2циклнн Е во втором клеточном
цикле после стимуляции клеток 1 и
. Влияние экспрессии антисмысловой РНК р на вхождение
клеток во второй цикл после стимуляции 1
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ БЛАГОДАРНОСТИ
Список сокращении
ВМ высокомолекулярная форма
КСП каноническая сигнальная последовательность для секреции
НМ низкомолскулярпая форма
ПФР полипептидные факторы роста
УП число удвоений популяции
ЭФЧ эмбриональные фибробласты человека
i i
СК1 iii
ivi i
i
i vi i
I i i ii ii
i
i i
x i i i i ii i
2 i
ii
2 i
3 i
i
i
I iii
I1 ii
МАРК iiv i i МАРК i v ii x ii i iv I3 iii 3 i
i
i i

v
i
v i
i
V v i
ВВЕДЕНИЕ


В качестве модели нормальных трансформированных клеток были выбраны фибробласты линии i ЗТЗ. Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе было исследовано влияние продолжительной стимуляции 1 и на пролиферацию клеток i ЗТЗ. Впервые было показано, что блок пролиферации при стимуляции клеток i ЗТЗ 1 и происходит в 1 периоде второго клеточного цикла. В работе биохимически охарактеризовано состояние клеток после блока пролиферации во втором цикле при их стимуляции 1 и . Показано, что рецепторы 1 и остаются фосфорилированными во втором цикле, так же как и МАР киназы и Егк2, проводящие пролиферативный сигнал в клеточные ядра. Во втором цикле при стимуляции клеток 1 наблюдается экспрессия мРНК генов раннего , и задержанного ответов. Показано, что в клетках, блокированных во втором клеточном цикле при их стимуляции 1 и , выражена экспрессия циклинов 1 и Е, но отсутствует экспрессия циклина А. Искусственная экспрессия циклина А не приводит к увеличению доли клеток, вступающих во второй цикл при стимуляции 1. В работе также показано, что в клетках, стимулированных 1, значительно повышена экспрессия ингибитора , р, в то время как при стимуляции в клетках наблюдается аккумуляция р. Сбк2циклии Е при стимуляции клеток соответственно 1 или и ингибируют активность этого комплекса во втором цикле. Используя антисмысловую мРНК р, показано, что повышенная экспрессия р является одной из причин, блокирующих пролиферацию клеток i ЗТЗ при стимуляции 1. Научнопрактическое значение работы состоит в том, что в ней получены новые данные, демонстрирующие ограниченность пролиферативного эффекта индивидуальных ПФР одним клеточным циклом гг проливающие свет на биохимические механизмы, определяющие эту ограниченность. На основе полученных в данной работе результатов можно предположить, что большинство клеток при стимуляции индивидуальными ПФР задерживается во втором клеточном цикле. Дальнейшее исследование механизмов задержки во втором цикле должно способствовать разработке новых подходов к предотвращению гиперплазии и опухолеобразования, а также усовершенствованию методов применения ростовых факторов в клинике. Последовательность событий, происходящих от момента образования клетки в результате деления до окончания ее деления на две дочерние клетки, называется клеточным циклом. Клеточный никл у эукариот обычно состоит из двух основных периодов, во время которых происходит синтез ДНК Б и митоз М, и двух промежуточных фаз, во время которых клетки готовятся к началу удвоения ДНК и клеточному делению Схема 1. Общая продолжительность как всего клеточного цикла, так и отдельных его фаз варьируют не только у разных организмов, но у клеток разных тканей и органов одного организма. Универсальная теория клеточного цикла предполагает, что клетка как целое в течение клеточного цикла проходит через ряд специфических состояний. В каждом состоянии критические регуляторные белки претерпевают фосфорнлированис или дефосфорилирование, определяющие их активность, взаимодействия иили внутриклеточную локализацию. Прикрепленным клеткам, например фибробластам, требуются как стимуляция растворимыми митогсиами, так и прикрепление к субстрату для прохождения фазы и вхождения в Б фазу. Схема 1 Схематическое изображение регуляции клеточного цикла. Цнклнны, участвующие в регуляции клеточного цикла, экспрессируются в определенные его периоды. Циклииы активируют цнклинзавненмые киназы , i i, которые обычно находятся в ядре, что в свою очередь приводит к фосфорилированию различных белковмишеней по ссриповым и трсопиповым аминокислотным остаткам и способствует прогрессии клеточного цикла. Контроль активности комплексов циклин осуществляется специфическим фосфорилированисмдефосфорилированисм , а также двумя семействами ингибиторов. Цнклнны А, В, и Е инактивируются во время каждого клеточного цикла путем убиквитинзависимого протеолиза, который происходит в определенные моменты цикла. Циклииы, и ингибиторы являются основными элементами сигнального пути, который регулирует вхождение клеток в цикл и прохождение через него. Е2Рзависимых промоторов.