Новый белок, локализованный на межсубъединичной поверхности рибосом Escherichia coli

• Автор: Агафонов, Дмитрий Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Раздел 1. Структурная организация рибосомы

Раздел 2. Краткий обзор метода тритиевой бомбардировки

2.1. Введение

2.2. Принцип метода тритиевой бомбардировки.

2.3. Тритиевая бомбардировка белков и макромолекулярных комплексов

2.4. Тритиевая бомбардировка целых клеток

Раздел 3. Белки холодового шока ii i.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Раздел 4. Методы, использованные в работе
4.1. Рост бактериальной массы . i 0
4.2. Получение двукратнопромытых рибосом . i.
4.3. Получение четырехкратнопромытых рибосом . i
4.4. Получение изолированных и рибосомных субчастиц . i
4.5. Процедура тритиевой .бомбардировки
4.6. Мечеиие суммарного рибосомного белка
в денату рирующих условиях.
4.7. Мечение рибосом.
4.8. Мечение развернутых субчастиц рибосомы
4.9. Мечение рибосом, диссоциированных на субчастицы
4 Двумерный электрофорез рибосомных белков
по Мадьяру.
4 Флюорография.
4 Количественный анализ распределения метки
между индивидуальными белками рибосомы
4 Новая процедура двумерного электрофореза рибосомных белков.
4 Одномерный электрофорез но фон Ягову.
Раздел 5. Идентификация и выделение белка У
5.1 Определение концевой аминокислотной
последовательности белка
5.2. Выделение белка .
5.2.1. Получение обогащенной фракции белка
из рибосом .i.
5.2.2. Анионообменная хроматография
на сефарозе
5.2.3. Гидрофобная хроматография
на .
5.3. Идентификация выделенного препарата белка
5.4. Массспектрометрия.
Раздел 6. Функциональные свойства белка
6.1. Связывание белка с рибосомой . i.
6.2. Тритиевая бомбардировка комплексов белка с изолированной субчастицей и рибосомой
6.3. Магниевая зависимость диссоциации рибосом
по данным светорассеяния.
6.4. Седиментационный анализ рибосом
6.5. Получение грубой рибосомной фракции из клеток
.i, подвергнутых холодовому шоку.
6.6. Бссклеточная система трансляции
мРПК зеленого флуоресцентного белка ЗФБ
6.7. Бесклеточная система трансляции
6.8. Связывание аминоацил с рибосомой
6.9. Связывание тетрациклина с рибосомой
Раздел 7. Материалы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Раздел 8. Мечение рибосомных белков
в денатурирующих условиях
Раздел 9. Белки, экспонированные на поверхности
интактной рибосомы.
Раздел . Белки, экспонированные на поверхности
развернутых субъединиц рибосомы
Раздел . Белки на контактирующей поверхности
и субъединиц рибосомы
Раздел . Идентификация и выделение белка .
.1. Определение концсвой аминокислотной последовательности белка
.2. Выделение белка и идентификация
выделенного препарата
.3. Массспектрометрия белка
Раздел . Функциональные свойства белка .
.1. Локализация участка связывания белка
.1.1. Связывание белка с рибосомой и изолированными рибосомными субъединицам и
.1.2. зависимость связывания
.1.3. Экспонированность белка на поверхности изолированной
субъединицы и рибосомы
.2. Влияние белка У на способность
рибосом к диссоциации
.2.1. Магниевая зависимость диссоциации рибосом в присутствии белка У
по данным светорассеяния
.2.2. Седиментационный анализ рибосом
в присутствии белка У.
.3. Появление белка У в рибосомной фракции
в зависимости от условий роста клеток
.3.1. Холодовой шок
.3.2. Стационарная фаза роста
.4. Влияние белка У на работу
бесклеточных систем трансляции.
.4.1. Трансляция мРНК
зеленого флуоресцентного белка
.4.2. Трансляция роуV.
.5. Влияние белка У на связывание
аминоацилтРНК с Я рибосомой.
.6. Влияние белка У на связывание
тетрациклина с 8 рибосомой.
РЕЗЮМЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ВВЕДЕНИЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Раздел 1. Раздел 2. Принцип метода тритиевой бомбардировки. Раздел 3. Белки холодового шока ii i. Раздел 4. Рост бактериальной массы . Получение двукратнопромытых рибосом . Получение четырехкратнопромытых рибосом . Получение изолированных и рибосомных субчастиц . Процедура тритиевой . Мечение рибосом. Мадьяру. Флюорография. Новая процедура двумерного электрофореза рибосомных белков. Одномерный электрофорез но фон Ягову. Раздел 5. Выделение белка . .i. . Массспектрометрия. Раздел 6. Связывание белка с рибосомой . .i, подвергнутых холодовому шоку. Раздел 7. Раздел 8. Раздел 9. рибосомы. Раздел . Раздел . Раздел . Идентификация и выделение белка . Раздел . Функциональные свойства белка . Трансляция роуV. РНК с Я рибосомой. РЕЗЮМЕ. ВЫВОДЫ. Трицин трисгидрокси м ети лмети л гл ицин i трисгидроксиметиламинометан Бистрис 2бис2гидроксиэтилимино2гидроксиметил 1,3пропандиол этилендиаминотстраацстат ТЕМЕД ,, , тетраметилэтилендиамин . Рибосома является молекулярной машиной, осуществляющей синтез всех белков во всех живых организмах. Полную рибосому составляют две субъединицы, большая и малая для прокариот 8 и 8 соответственно, диссоциирующие друг от друга при понижении концентрации ионов магния. Механизм функционирования рибосомы на молекулярном уровне остается невыясненным. Выяснение механизма работы рибосомы является одной из самых интересных и сложных проблем молекулярной биологии. В процессе своего функционального цикла рибосома взаимодействует с макромолекулярными лигандами, такими, как мРНК, тРНК, белковые факторы трансляции. Эти крупные лиганды взаимодействуют с определенными участками рибосомной поверхности, имеющими сродство к тому или иному фактору или субстрату участки связывания. Таким образом, изучение топографии поверхности рибосомы имеет огромное значение для детального выяснения механизма ее функционирования. Цель настоящей работы изучение методом тритисвой бомбардировки поверхности рибосом и рибосомных субъединиц. Метод тритиевой бомбардировки позволяет мстить рибосомиые белки, экспонированные на поверхности рибосом. Степень мечения индивидуальных белков рибосомы пропорциональна степени их эксионированности. В настоящей работе был разработан метод количественного измерения степени эксионированности белков на поверхности рибосомы. На основании количественных данных индивидуальные белки рибосомы были классифицированы по степени экспопированности. В ходе работы был обнаружен новый белок, названный белком У, не являющийся рибосомным и локализующийся на рибосомном интерфейсе. ХОЛОДОВОЙ ОК. Материал диссертации изложен в четырех частях. Первая часть посвящена обзору литературы по использованию тритиевой бомбардировки для изучения топографии биологических макромолекул, а также сделан обзор функциональных свойств белков холодовот шока. Во второй части описаны материалы и методы, использованные в работе. В третьем и четвертом разделах диссертации описаны и обсуждены результаты изучения топографии рибосом методом тритиевой бомбардировки.