Специфичность транспозиции мобильных элементов МДГ4 и IS1 : Роль интегразы и клеточного фактора IHF

• Автор: Глухов, Игорь Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 103 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

1.1. Классические транспозоны

1.1.1. Бактериальные транспозирующие элементы Iэлементы

1.1.2. Эукариотические транспозирующие элементы ДНКэлементы

1.2. Ретроэлементы.

1.2.1. Неавтономные ретротранспозоны ретропозоны.

1.2.2. Автономные ретротранспозоны

1.2.2.а. Iподобные элементы
1.2.2.6. Мобильные интроны группы II
1.2.2.В. Эндогенные ретровирусы
1.2.2.Г. ретротранспозоны
ГЛАВА 2. МДГ4
2.1. Открытие мобильного генетического элемента МДГ4
2.2. МДГ4 содержащий ретротранспозон
2.2.1. Регуляторные элементы
2.2.2. Открытые рамки считывания 1 и 2
2.2.3. 3 и инфекционностъ МДГ4
ГЛАВА 3. ИНТЕГРАЗЫ РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ
3.1. Роль интегразы в транспозиции
3.2. Структурно функциональные свойства интеграз
3.2.1. Ыконцевой домен
3.2.2. Центральный домен
3.2.3. Сконцевой домен
3.2.4. Каталитические функции
3.2.4.а. 3 процессинг
З.2.4.6. Нуклеотидилтрансферазная реакция
3.2.4.В. Реакция дезинтеграции
3.2.5. Взаимодействие с ДНК
3.2.6. Образование мультимеров
3.2.7. Взаимодействие с другими белками
3.3. Гибридные интегразы
ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1.1. Материалы
1.1.1. Штаммы бактерий, векторные и рекомбинантные плазмиды
1.1.2. Реактивы
1.1.3. Среды и основные растворы
1 Ферменты
1.2. Методы исследований
1.2.1. Выделение плазмидной ДНК
1.2.2. Препаративная очистка фрагментов ДНК
1.2.3. Лигирование
1.2.4. Получение компетентных клеток и их трансформация
1.2.5. Анализ рекомбинантных клонов
1.2.6. Определение первичной последовательности ДНК
1.2.7. Радиоактивное меченье и очистка олигонуклеотидов, формирование дуплексов.
1.2.8. Клонирование интегразы МДГ4
1.2.9. Введение аминокислотной замен ы
1.2 Экспрессия рекомбинантного гена
1.2 Очистка рекомбинантного белка НТМ
1.2 Определение эндонуклеазной активности
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Клонирование и экспрессия гена М МДГ4
2.1.1. Клонирование
2.1.2. Редкие аргининовые кодоны
2.1.3. Агрегация рекомбинантного белка в Е.соН
2.2. Изучение эндонуклеазной активности рекомбинантного белка
I МДГ4
2.2.1. Специфическое никирование концевой нуклеотидной последовательности
2.2.2. Сайтспецифический гидролиз ДНКмишени
2.2.3. Влияние конформации ДНКмишени на эффективность гидролиза
2.3. Сравнительный анализ вторичной структуры конца
интегразного домена полипротеина МДГ4. Связь структуры МН2домена с его функцией
2.4. Сайтовая и региональная специфичность транспозиции мобильного инсерционного элемента I1
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА I. Ретроэлементы. Неавтономные ретротранспозоны ретропозоны. ГЛАВА 2. ГЛАВА 3. З.2. ГЛАВА I. Радиоактивное меченье и очистка олигонуклеотидов, формирование дуплексов. ГЛАВА II. Агрегация рекомбинантного белка в Е. МДГ4. I ii инсерционная последовательность. I i длинные диспергированные по геному элементы. МЭ мобильный элемент. МДГ4 мобильный диспергированный ген 4 ретротранспозон МДГ4. I iv инвертирований повтор. i длинный концевой повтор. i открытая рамка считывания. полипротеин вириона или вирусоподобной частицы. полииротеин, содержащий протеазный, ревертазный, РНКазы Н и интегразный домены. V полипротеин оболочки. протеаза. рсвергаза. РНКаза Н. I иитсграза. II iii гистидиновый префикс для рекомбинантного белка. I рекомбинантная интеграза, содержащая НТ. III ii хозяйский фактор интеграции. V вирус саркомы птиц. V вирус саркомы Рауса. V вирус Молони лейкоза мышей. V спумавирус кошек. V спумавирус обезьян. IV 1 вирус иммунодефицита человека тип 1. IV2 вирус иммунодефицита человека тип 2. Ба килодальтон. Мол. ПЦР полимеразная цепная реакция. ЯМР ядерный магнитный резонанс. ПЛАТ полиакриламидный гель. ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота. РНК рибонуклеиновая кислота. РНК транспортная рибонуклеиновая кислота. БСА бычий сывороточный альбумин. ЭДТЛ этиясндиаминтетрауксусная кислота. ИГГГГ изонропилтиогалактозид. Трис трисгидроксиметиламинометан. додецилсульфат натрия. дитиотрейтол. МЭ АТР аденозин5трифосфат. дсзоксиаденозин5трифосфат. i нитротриацетат никеля. Мобильные элементы, составляющие значительную часть генетического материала про и эукариотических клеток, являются существенным фактором генетического разнообразия и нестабильности организмов. Перемещение мобильных элементов, которые могут встраиваться в различные участки генома, очевидно, влияет на структуру и функционирование генов. Такие элементы кодируют интегразу или транспозазу, функционально и структурно родственный фермент см. Сару . ДНКконий в хромосому клеткихозяина. Как правило, сайт иили область встраивания являются не случайными. Конкретные молекулярные механизмы, определяющие выбор сайта области интеграции, для большинства мобильных элементов практически не известны. Индивидуальные свойства интефазы, последовательность ДНК, структура хроматина, специфические белки клеткихозяина могут влиять на этот выбор. Бактериальный мобильный элемент I1 обладает сайтовой и региональной специфичностью. Предпочтительные районы интеграции I1 содержат сайт связывания для клеточного белкового фактора I . Однако участие I в феномене специфичности транспозиции I 1элемента не показано. Мобильный генетический элемент МДГ4 является уникальным ретровирусом дрозофилы Семин, Ильин, i . . Ранее было показано, что эксцизия МДГ4 i viv происходит из геномных сайтов с точным восстановлением нуклеотидной последовательности генов i, i, iv, Ii, i, .