Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы

• Автор: Тотменин, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 215 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярнобиологическая организация ортопоксвирусов.

1.2. Организация генома ортопоксвирусов.

1.3. Гены круга хозяев

Я 1.4. Молекулярные факторы вирулентности ортопоксвирусов.

1.5. Структурные перестройки в геномах ортопоксвирусов

1.6. Модели возникновения дупликаций, транспозиций и делеций концевых последовательностей

1.7. Гомологичная рекомбинация

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы
2.2. Выделение и анализ плазмидной ДНК
2.3. Получение компетентных клеток Е.соИ
2.4. Трансформация компетентных клеток Е.соН
2.5. Получение геномных библиотек в космидном векторе.
2.6. Компьютерный анализ данных ссквснирования
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание плазмидных и космидных клонотек фрагментов ДНК ВНО
Щ штамма Индия.
3.1.1. Получение и характеризация коллекций гибридных плазмид, содержащих ЯжIII и А7о1фрагменты ДНК ВНО штамма Индия.
3.1.2. Получение и характеризация библиотеки космид, содержащих ЯжИНфрагменты ДНК ВНО штамма Индия
3.1.3. Использование полученных клонотек фрагментов ДНК ВНОИНД для секвенирования полной кодирующей последовательности генома данного вируса
3.2. Получение и характеризация коллекции гибридных плазмид, содержащих АТиЛфрагменты генома ВНО штамма Гарсия
3.3. Создание международного репозитория гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО.
Щ 3.4. Организация генома вируса vi ВНОИНД.
3.5. Сравнение геномов вирусов ВНО и ВОВ.
3.6. Организация генома штамма Гарсия ВНО i i
3.7. Сравнение геномов вирусов ВНО и вируса оспы верблюдов.
3.8. Сравнение организации молекулярных факторов вирулентности ВНО, ВОВ и ВОВБ
3.9. Интегральная схема преодоления вирусом натуральной оспы
защитных барьеров организма.
3 Молекулярная эволюция ортопоксвирусов.
31. Различия в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной оспы и осповакцины
32. Механизмы рекомбинационных перестроек ортопоксвирусных ДНК.
4. ВЫВОДЫ.
4 5. ПРИЛОЖЕНИЕ 1.
6. ПРИЛОЖЕНИЕ 2.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВНО вирус натуральной оспы
ВОВ вирус осповакцины
ВОК вирус оспы коров
ВОО вирус оспы обезьян
ВЭ вирус эктромелии
ИПТГ изопропилтиогалактозид
кДа килодальтон
ОРТ открытая рамка трансляции
ПЦР полимеразная цепная реакция
РКЭ развивающиеся куриные эмбрионы
ФНО фактор некроза опухолей
ХАО хорионаллантоисные оболочки
ак аминокислота аминокислотный остаток
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
I гаммаинтерферон
I интерлейкин1
I инвертированные концевые повторы
НА гемагглютинин
фактор некроза опухолей i
рецептор фактора некроза опухолей
V комплсмснтконтролирующий белок
V вирусный фактор роста
X 5бром4 хлорЗиндолилрОгалакгозид
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Концевые области генома ортопоксвирусов содержат гены, которые не являются жизненно важными для репликации вируса в культуре клеток Регкиэ е а1. Число выявленных к настоящему времени факторов вирулентности ВОВ приближается к двум десяткам, а белков, упаковывающихся в вирион к пятидесяти. В то же время, все ферменты, необходимые для репликации ДНК и синтеза полноценных вирусных мРНК расположены в центральном районе генома. Метаболизм вирусов животных в зависимости от их особенностей направлен на использование структур цитоплазматического или ядерного белкового скелета клеток. В частности, полагают, что вирусспецифичный цитопатический эффект обусловлен не бессмысленным для вируса повреждением клетки, а специфичной перестройкой элементов клеточного скелета, цель которой создание условий для размножения вируса Пснмен, . Белки цитоскелета кодируются большим набором разных генов, для которых характерна тканеспецифичная экспрессия. Это обусловливает различие состава белкового каркаса разных типов клеток, что сказывается на функциях этих клеток. Указанные различия могут влиять на такой параметр размножения вируса внутри организма, как тканевой тропизм. Известно, что разные виды ортопоксвирусов значительно различаются по спектру животных, в организме которых они способны размножаться. Так, вирус оспы коров ВОК имеет очень широкий круг чувствительных к нему хозяев Маренникова и др. В то же время ВНО и вирус оспы мышей эктромелии, ВЭ имеют очень узкий круг чувствительных животных. ВНО в естественных условиях заражает лишь человека, а ВЭ некоторые линии мышей . Такое разнообразие ортопоксвирусов по спектру чувствительных к ним хозяев позволяет надеяться на выявление вирусных генов, контролирующих эти свойства вирусов. В последние годы предпринимаются активные попытки выявления генов круга хозяев ортопоксвирусов. К сожалению для системы i viv по изменению спектра чувствительных животных такие гены пока не идентифицированы. Однако для культур клеток система i vi выявлены, по крйней мере, три гена ортопоксвирусов, определяющих возможность вирусов размножаться на тех или иных линиях клеток млекопитающих . ВОВ не способен размножаться на линии клеток китайского хомячка СНО, в то время как ВОК таким свойством обладает. Показано, что за данное свойство ВОК ответственен ген, получивший название СНО и кодирующий белок кДа . Интеграция этого гена ВОК в геном ВОВ приводит к тому, что последний приобретает способность размножаться на клетках СНО. Кроме того, в геноме ВОВ идентифицирован ген 1 i . , а также ген 7 . I ВОВ для размножения в клетках человека 5 и свиньи 1. Важно отметить, что ген СНО ВОК способен комплсментировать функции как гена 1 ВОВ, так и 7 ВОВ, но не наоборот, т. . РНК вируса и тем самым обеспечивает экспрессию поздних генов вируса i , . Ген . ВОВ в клетках индуцирует синтез клеточного фактора VI2, необходимого для транскрипции промежуточных генов вируса . В клетках, пермиссивных для . , V12 синтезируется и в отсутствие инфицирования. Кроме того, показано i , , что для 1 в клетках наблюдается блокирование трансляции ранних мРНК вируса. Введение гена СНО СР в геном 1 приводит к тому, что 1 размножается на линии , хотя и формирует бляшки гораздо меньшего размера по сравнению с вирусом дикого типа. Более того, первоначально первые 6 час такой вариант вируса ведет себя в клетках линии как 1, т. i , . Белки СНО и 1 не имеют выраженной гомологии по аминокислотной последовательности, но их важной особенностью является то, что они относятся к семейству анкирииподобных белков Щелкунов и др. Сафронов и др. x . . Для белка 7 какихлибо гомологов или аналогов среди известных белков не обнаружено i . Поксвирусы, как указывалось выше, являются сложно организованными цитоплазматическими вирусами разд.