Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15

• Автор: Дорохов, Борис Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 88 с. : ил.

Введение. 4

Обзор литературы. 5

Бактериофаг i 9

Плазмида . ю

Плазмида i
Плазмида 2.

Внутриклеточная локализация плазмид

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага .

Цели и задачи работы.

Задачи работы.

Материалы и методы.

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды
Плазмиды, используемые для экспрессии генов
Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными
геном при анализе транскрипции оперона .
Плазмиды и штаммы, используемые для и i xi
анализа транскрипции оперона .
Плазмиды, используемые в эксперименте по изучению регуляции
экспрессии гена протеломеразы бактериофага .
Плазмиды, используемые для определения скорости потери линейных
репликонов .
Плазмиды, используемые для определения внутриклеточной локализации
линейных репликонов
Трансформация . i
Выделение плазмиднойДНК
Электрофорез ДНК.
Определение активности промотора.
Анализ транскриптов с помощью ОТПЦР.
Определение активности промотора
Определение эффективности трансформации
Флуоресцентная микроскопия.
Определение скорости потери линейных плазмид.
Результаты.
Регуляция экспрессии оперона .
Структура оперона плазмиды .
Связывание белков с i промотором.
ОТПЦР анализ транскриптов оперона .
Структурная организация промоторной области гена
протеломеразы
Регуляция экспрессии промотора протеломеразы.
Роль протеломеразы в стабилизации концов линейной ДНК
Внутриклеточная локализация. Многокопийное состояние.
Внутриклеточная локализация. Однокопийное состояние
Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне .
Обсуждение.
Регуляция экспрессии оперона.
Внутриклеточная локализация плазмид
Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды
Список публикаций по теме диссертации
Цитированная литература 8о
Введение


Мы исследуем явление стабильного наследования на примере бактериофага , особенностью которого является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому ii i, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами. Стабильное наследование плазмиды обеспечивается локусом, имеющим гомологию с локусом плазмиды , но центромерный сайт не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с опероном, как в плазмиде , а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме, причем каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры vi , iiv , . В то время опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что оперон , помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. Изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих правильное распределение линейных низкокопийных плазмид в бактериальных клетках, внесет важный вклад в понимание механизмов наследования генетического материала у прокариот. Механизм распределения бактериальных плазмид и хромосом между будущими дочерними клетками при делении, наряду с работой аппарата репликации ДНК, является необходимым для стабильного наследования генетического материала. Высококопийные плазмиды не требуют наличия специальных механизмов сегрегационной стабильности для гарантированного распределения их реплицированных копий между дочерними клетками при делении. Случайного пассивного распределения вполне достаточно, чтобы, как минимум, одна копия оказалась в каждой из дочерних клеток. Низкокопийные плазмиды должны обладать специальным механизмом для обеспечения гарантированного наследования. Первые работы по изучению активного процесса сегрегации и связанных с этим явлением генов были проведены для низкокопийных плазмид ii i i и . В дальнейшем, в плазмидах разнообразных бактерий экспериментально, иили компьютерным анализом последовательностей геномов были найдены аналогичные, обнаруженным у i и сегрегационные модули, ответственные за стабильное наследование. Обычно сегрегационный модуль состоит из двух генов, кодирующих трансактивные белки, способные образовывать комплекс на цисактивном центромерном сайте ДНК. Первый из двух генов в опероне кодирует белок, как правило, называемый РагА, второй ген кодирует белок, который является ДНКсвязывающим фактором РагВ. Существует значительная неоднородность в размерах и последовательности РагА белков, но одни из них обладают слабой АТФазной активностью и содержат АТФазный мотив РагА, другие же являются актиноподобными белками , . В случае плазмиды i, кодирующей РагМ актиновый гомолог, АТФопосредованная двунаправленная полимеризация этого белка обеспечивает внутриклеточный транспорт прикрепленных плазмид к центрам будущих дочерних клеток . Известные на настоящий момент данные говорят о том, что и белок РагА также управляет распределением плазмид за счет активного процесса полимеризации , i . Начальной стадией процесса сегрегации является сборка нуклеопротеинового комплекса на центромере, так называемой сегросомы. Механизм наиболее хорошо изучен на примере бактериофагов i и Р7. Эти фаги являются родственными, содержат протяженные участки гомологии см. Е. i а представляют собой кольцевые низкокопийные плазмиды. Все компоненеты системы сегрегационной стабильности локализованы в одном локусе, i , , . Этотлокус включает авторегулируемый оперон, состоящий из двух генов, рагА и В, а также содействующий сайт , следующий за геном . РагВ vi . I.
Рисунок 1. Организация сегрегационного модуля. Оперон состоит из двух генов, кодирующих или актиноподобную АТФазу показано серым цветом и белок, способный связываться с центромерой красный. Происходит сборка комплекса на центромере белый квадрат, расположеной после или перед опероном. Фактор связывания с центромерой вовлекает АТФазу, которая, в свою очередь полимеризуется и направляет плазм иду к центру будущей дочерней клетки i, . Основная последовательность, обеспечивающая связывание РагВ, это гептамер , называемый Бокс А.