Влияние функциональных элементов в лидерах прокариотических мРНК на эффективность инициации трансляции

• Автор: Комарова, Анастасия Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Общая характеристика работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурнофункциональные элементы в областях инициации трансляции мРНК и современные модели образования инициаторных комплексов у прокариот
1. Введение. Современные представления об ининиацин трансляции у прокариот и эукариот сходство и различия

2. Каноническая схема инициации трансляции прокариотических мРНК

2.1. Участок связывания рибосомы

2.2. Трансляционный инициаторный район ТИР

2.3. Роль вторичной структуры мРНК в и ТИР

2.4. ТИР и возможные механизмы трансляционного усиления

2.4.1. Существует ли x

2.4.2.Трансляционные энханссры в 5НТО и механизмы усиления трансляции
Полифункциональность рибосомного белка
Строение и свойства белка I
Белок 1 и инициация трансляции
3. Неканонические механизмы инициации трансляции у прокариот
3.1. Примеры трансляции в отсутствие последовательности ШайнаДальгарно
3.2. Примеры усложненных и позитивная роль вторичной структуры в инициации трансляции
3.3. Область инициации трансляции мРНК белка малой субчастицы рибосомы 1
3.4. Инициация трансляции на мРНК, не имеющих лидерной последовательности безлидерных
4. Заключение и перспективы
Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Введение
2. Эффективность трансляции мРНК, содержащих сильный домен
2.1. Выбор .
2.2. Создание хромосомных конструкций для оценки выхода белка с одной копии гена
2.3. Результаты измерения ргалактозидазной активности в полученных рекомбинантных штаммах
2.4. Проверка эффективности образования тройного инициаторного комплекса i vi с помощью метода тоупринтанализ
2.5. Возможные причины ингибирующег о влияния протяженных дуплексов на трансляцию
3. Эффективность трансляции мРНК, содержащих богатыс участки в 5сторону от протяженной носледовательности 3.1. Антитерминация транскрипции оперонов рибосомных РНК. БоксАэлсмснт и его функциональные комплексы с клеточными белками 3.2. Оценка эффективности образования трансляционного инициаторного комплекса i viv и i vi
3.3. Применение метода торможения в геле для оценки аффинности 1 к мРНК
лидерам, содержащим и не содержащим трансляционные энхансеры 3.4. Биолог ический смысл Аи богатых последовательностей в лидерах
прокариотических мРНК
3.5. О возможной роли белка Б1 в процессе антитерминации транскрипции
4. Зависимость стабильности мРНК от строения 5НТО
5. Заключение
Глава 3. МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и оборудование
1.1. Ферменты и реактивы
1.2. Оборудование
1.3. Расходные материалы
1.4. Буферные и другие растворы
1.5. Микробиологические среды
1.6. Концентрации антибиотиков
1.7. Олигонуклеотиды, использованные в работе
1.8. Штаммы и плазмиды
2. Методы
2.1. Получение илазмидных конструкций для экспериментов i viv и i vi
2.2. Эксперименты i viv
Трансформация
Гомологическая рекомбинация
трансдукция
А. Приготовление фагового лизата
Б. Трансдукция с исползованием Р1фаголизатов
Измерение активности 3галактозидазы в клеточных экстрактах
Определение количества белка по методу Брздфорд
Выделение РНК из клеток для Нозсон б лотгибридизации
2.3. Эксперименты i vi
Нозеонблот гибридизация
ДНК зонды для гибридизации
Анализ комплексов мРИК методом торможения в геле
ЛСНПААГ электрофорез белков по методу Лэммли
Анализ формирования БмРНКтРНКМс инициаторного комплекса т vi
тоупринтинг
Секвенирование вставок в вектор оЕМВ1.Д по Сэнгсру
Выводы
Список литературы


Очевидно, что для понимания фундаментальных основ трансляции и механизмов се контроля требуются интенсивные исследования. Механизмы инициации трансляции у про и эукариот существенно различаются, хотя и имеют много общего. В обоих случаях в узнавании и связывании мРНК участвуют не целые рибосомы, а их малые субчастицы у прокариот и у эукариот, которые и осуществляют поиск стартовой точки трансляции. В этом поиске также принимают участие специальные белковые факторы Iiii , причем у прокариот их зри I1, I2, I3, а у эукариот несравнимо больше. В качестве инициирующего кодона в большинстве случаев выступает триплет . У эукариот он практически единственный инициаторный кодон, а у прокариот всех кодирующих последовательностей начинаются с него i . Как у прокариоз, так и у эукариот для узнавания инициаторного кодона используется специальная инициаторная мстионилтРНК у прокариот метионильный остаток формилирован, и синтез белка начинается с метионина, независимо от варианта инициаторного тринлега. Основные различия в механизмах инициации определяются наличием у эукариот и отсугствием у прокариот ядра и сводятся к следующим Рис. Вопервых, прокариотические мРНК начинают транслироваться еще до окончания их транскрипции РисЛ. Л., и, как правило, они очень нестабильны период полураспада для большинства бактериальных мРНК всего несколько минут. Быстрое вовлечение в белковый синтез, с одной стороны, и нестабильность мРНК бактерий с другой, обеспечивают оперативный контроль белкового синтеза. Эукариотические мРНК довольно стабильны. Период их полураспада измеряется часами и даже сутками. Их транскрипция и трансляция пространственно разобщены Рис. Б. Транскрипция протекает в ядре, а трансляция в цитоплазме. В ядре эукариотические мРНК синтезируются в виде предшественников и проходят в своем биогенезе стадии сложного созревания, или процессинга. Вовторых, прокариотические мРНК в большинстве случаев являются полицистронными, то есть содержат информацию для синтеза нескольких полипептидных белковых цепей. Зрелые эукариотические мРНК, как правило, моноцистронны и кодируют только одну полипептидную цепь. Наконец, эукариотические клеточные не вирусные мРНК имеют на 5конце кэпструктуру и полиА последовательность па Зкоице. Кэпировапие и полиаденилированис происходит в ядре в процессе созревания мРНК, и только потом она отправляется в цитоплазму для белкового синтеза. У прокариот полиА последовательность участвует в быстрой деградации мРНК и не влияет на с трансляционные функции, в то время как у эукариот полиА последовательность связывается с определенным белком и этот комплекс участвует в модулировании инициации трансляции на стадии узнавания 5кэпструктуры специальными инициаторными факторами. Как для прокариот, так и для эукариот сформулированы канонические механизмы, по которым происходит сборка инициаторных комплексов. У прокариот малая рибосомная субчастица с факторами инициации имеет повышенное сродство к специальному внутреннему неконцевому участку мРНК, называемому инициаторным, или рибосомсвязывающим участком. РНК, она закрепляется на нм. Не вдаваясь в сложные детали сборки инициаторного комплекса у эукариот, следует сказать, что каноническим механизмом инициации трансляции в этом случае считается кэп и факторзависимос связывание субчастицы рибосомы с метионилтРНК, вблизи от 5конца мРНК, и последующее последовательное перемещение в 3направлении до первого инициаторного кодона . При таком способе инициации трансляции у эукариот, последовательность мРНК как бы просматривается сканируется с начала мРНК от ее кэпструктуры для поиска кодона в оптимальном контексте. Такая инициация получила название кэпзависимая инициация по сканирующему механизму. Исследования последних лет показали, что наряду с классическими схемами как для прокариот, так и для эукариот, существуют неканонические механизмы, по когорым инициаторный комплекс собирается не только на вирусных фаговых для бактерий, но и на ряде клеточных мРНК . Разнообразию механизмов, по которым происходит рекрутирование рибосом прокариотическими мРНК, и посвящен данный обзор.