Разработка методов полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидных микрочипах для видовой идентификации микроорганизмов и определение их лекарственной чувствительности

• Автор: Грядунов, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил

Введение .

2. Литературный обзор.

2Л. Амнлификационные технологии на олигонуклеотидных микрочипах и их применение .

2.1.1. Мультиплексная ПЦР и альтернативные методы амплификации Д1I мишени

2.1.2. Флуоресцентное мечение исследуемых образцов

2.1.3. Гибридизация на олигонуклеотидном микрочипе. Эффективность и специфичность процесса

2.1.4. Ферментативные реакции на микрочипах.

2.2. Молекулярная диагностика микобактерий.

2.2.1. Обнаружение микобактерий в клинических образцах

2.2.2. Видовая идентификация микобактерий в клинических изолятах

2.2.3. Генетические детерминанты устойчивости штаммов М i к антибиотикам.

2.2.4. Методы выявления мутаций, приводящих к устойчивости М. i к химиопрепаратам.
2.3. Генетические детерминанты патогенности и молекулярная диагностика возбудителя сибирской язвы i, i.
3. Методы
3.1. Олигонуклеотиды.
3.2. Приготовление микрочипов методом нанесения раствора олигонуклеотида на микроматрицу
3.3. Приготовление микрочипов методом сополимеризации
3.4. Подготовка образцов ДНК для проведения ПЦР
3.4.1. Подготовка ДНК для ПЦР из культур штаммов М
i
3.4.2. Подготовка ДНК для ПЦР из клинического образца
3.4.3. Выделение ДНК из вегетативных клеток В. и В. iii.
3.5. ЛДР па олигонуклсотидном микрочипе.
3.5.1. Подготовка ДНКматрицы для проведения ЛДР на микрочипе.
3.5.2. Проведение ЛДР на микрочипе
3.6. ПЦР на олигонуклсотидном микрочипе.
3.6.1. Проведение аллельспецифичной ПЦР на чипе с целью обнаружения мутаций в гене М. i.
3.6.2. Проведение мультиплексной ПЦР на чипе ПЦР на микрочипе с целью видовой идентификации микобактерий и обнаружения точечных мутаций в генах , , i, М i
3.6.3. Проведение мультиплексной ПЦР на чипе с целью детекции генов токсинообразования В. i, специфических последовательностей и нуклеотидного полиморфизма в генах и рРНК.
3.6.4. Проведение мультиплексной ПЦР на микрочипе с целью детекции генов токсинообразования В. i, ii i и микроорганизмов рода , а также специфических последовательностей в генах рРНК
3.7. Ссквенирование ДНК.
4. Результаты и обсуждение.
4.1. Разработка метода аллельспецифичной ПЦР на
олигонуклеотидных микрочинах
4.1.1. Определение алгоритма выбора праймеров в ПЦР на
микрочипе.
4.1.2. Выбор ДНКполимеразы.
4.1.3. Влияние удаленности олигонуклеотидов от поверхности геля
4.1.4. Определение оптимального соотношения праймеров в реакционной смеси.
4.1.5. Введение флуоресцентной метки в исследуемые образцы.
4.1.6. Влияние геля на эффективность ПЦР
4.1.7. Регистрация результатов анализа
4.1.8. Оптимизация температурновременного режима реакции.
4.1.9. Влияние поверхностной сорбции на чувствительность метода
4.2. Разработка метода обнаружения мутаций в гене гроВ методом ПЦР на олигонуклеотидном микрочипе
4.2.1. Обнаружение мутаций в гене гроВ на микрочипах,
изготовленных методом сополимеризации.
4.3. Анализ смесей ДНК дикого типа и мутантных вариантов с использованием ферментативных методов на микрочине
4.4. Видовая идентификация микобактерий и одновременное обнаружение устойчивых к рифампицину и изониазиду штаммов М. i методом мультиплексной ПЦР на микрочипе
4.5. Разработка метода обнаружения В. i методом мультиплексной ПЦР на микрочипе.
4.6. Разработка метода мультиплексной ПЦР на микрочипе для обнаружения В. i, ii i,
Благодарности.
Список литературы


Ускоренная идентификация возбудителей инфекционных заболеваний, требовательных к условиям культивирования или находящихся в количествах за пределами чувствительности стандартных диагностических методов, быстрое определение чувствительности микроорганизмов к лекарственным препаратам и их вирулентных свойств требуют дальнейшего развития надежных высокочувствительных методов идентификации. Одним из перспективных направлений является разработка методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют не только решить перечисленные задачи, но и могут быть использованы для генотипирования микроорганизмов и вирусов, идентификации геномного полиморфизма, ранней диагностики наследственных заболеваний. Существующие методы ПЦР, как правило, способны определять наличие одного или нескольких локусов в геноме изучаемого объекта, а также их изменения. При необходимости параллельного анализа большого количества фрагментов одного генома или целого ряда геномов представляется целесообразным разработка методов ПЦР на биологических микрочипах. Пространственное разделение разобщение праймеров в ячейках биочипа позволяет использовать десятки и сотни различных праймеров в одной реакции и, следовательно, значительно увеличить количество мишеней, идентифицируемых одновременно. За последние несколько лет было предложено несколько решений, позволяющих проводить полимеразную ценную реакцию непосредственно на ДНКмикрочинах. Однако, как правило, такие подходы находятся в стадии разработки, либо имеют ряд существенных ограничений. Это связано как с низкой эффективностью реакции, обусловленной сорбцией компонентов реакционной смеси на твердой фазе, так и необходимостью создания надежной процедуры регистрации продуктов реакции на чипе. ПЦР в твердой фазе. Использование полиакриламидного геля дает возможность проводить эффективную амплификацию в двухфазной системе. Создание специальной установки, состоящей из оргинального миниамплификатора, флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой, позволило контролировать ход реакции в реальном времени. С целыо апробации метода был создан микрочип, позволяющий проводить видовую идентификацию микобактерий и определять устойчивость i i к двум антимикобактериальным препаратам первого ряда, рифампицину и изониазиду. Сочетание мультиплексной ПЦР со специфическими праймерами с аплельспецифичной амплификацией демонстрирует возможность одновременной детекции генов, кодирующих диагностически важные белки, и минорного полиморфизма в генах, детерминирующих синтез рРНК. Литобзор. Амплификационные технологии на олигонуклеотидных микрочипах и их применение для анализа точечного нуклеотидного полиморфизма и идентификации микроорганизмов. Развитие технологий гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот ознаменовало новую эпоху в молекулярной биологии и позволило раскрыть природу многих наследственных заболеваний, исследовать структуру генома значительного числа патогенных микроорганизмов. В настоящее время эти подходы получили широкое распространение не только в исследовательской работе, но и в области клинической диагностики. Первые сообщения о применении молекулярнобиологических методов в диагностике, а именно гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами, появились в середине х годов. Эти методы быстро вошли в практику диагностических лабораторных служб многих стран. Вместе с тем, на первых этапах широкое применение молекулярно биологических методов идентификации нуклеиновых кислот НК сдерживалось необходимостью использовать токсические органические соединения, а также радиоактивные изотопы для регистрации результатов анализа. В значительной степени эти трудности были преодолены к началу х годов, когда на рынке диагностических средств появились тестсистемы, в которых использовались методы нерадиоактивной регистрации результатов и подготовки изучаемого образца, не требующей применения токсических органических соединений. В настоящее время многие ведущие биотехнологические компании уже производят наборы реагентов для проведения гибридизации с цслыо выявления инфекционных агентов вирусной и бактериальной природы.