Изучение механизма сайт-специфического действия Dam ДНК-{N6-аденин}-метилтрансферазы бактериофага Т4

• Автор: Евдокимов, Алексей Альбертович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 127 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ДНКМЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.

2.2. ОСОБЕННОСТИ ПЕРВИЧНЫХ СТРУКТУР МТАЗ

НА ПРИМЕРЕ АМИНОМТАЗ.

2.3. ТРЕТИЧНЫЕ СТРУКТУРЫ МТАЗ

2.4. ХИМИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК.

2.4.1. Метилирование эвдоциклического С5 атома цитозина.

2.4.2. Метилирование экзоциклических аминогрупп
аденина и цитозина.
2.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МТАЗ С ДОНОРОМ МЕТИЛЬНОЙ ГРУППЫ И ЕГО АНАЛОГАМИ
2.6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МТАЗ СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ДНК.
2.6.1. Стехиометрия взаимодействия
2.6.2. Связывание субстратных ДНК, влияние Ас1оМсТ
и его аналогов.
2.6.3. Деформация структуры ДНК.
2.7. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ДКМЕТИЛТРАНСФЕРАЗАМИ
2.7.1. Стационарные кинетические параметры реакций метилирования ДНК.
2.7.2. Кинетические механизмы реакций метилирования ДНК
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 МАТЕРИАЛЫ
3.1.1. Препараты ДНКметилтрансфераз
3.1.2. Олигодсзоксирибонуклеотидные субстраты.
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Измерение стационарных скоростей реакции метилирования ДНК.
3.2.2. Равновесные измерения интенсивности флуоресценции 2аминопуринсодержащих дуплексов.
3.2.3. Измерение интенсивности флуоресценции в режиме остановленной струи.
3.2.4. Регрессионный анализ экспериментальных данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. СРАВНЕНИЕ СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ ДНКДУПЛЕКСОВ,
СОДЕРЖАЩИХ КАНОНИЧЕСКИЙ ИЛИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ УЧАСТОК УЗНАВАНИЯ 4 МТАЗЫ
4.1.1. Дизайн олигодезоксирибонуклсотидных субстратов.
4.1.2. Метилирование 4 МТазой дефектных олигонуклеотидных дуплексов при различных температурах.
4.1.3. Стационарные кинетические параметры метилирования канонических и дефектных субстратов.
4.1.4. Эффект введения в участок узнавания модифицированных пуриновых оснований.
4.1.5. Локализация отдельных элементов участка узнавания
определяющих специфичность взаимодействия с Таш
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ Таш МТАЗЫ
4.2.1. Проверка возможности обратной реакции деметилирования
4.2.2. Предстационарная фаза реакции
4.2.3. Измерение скоростей метилирования при одновременном варьировании концентраций субстратов.
4.2.4. Ингибиторный анализ реакции
4.2.5. Особенности реакции в условиях высоких концентраций субстратов
4.2.6. Анализ альтернативных моделей кинетического механизма действия Таш.
4.3. ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ Таш МТАЗЫ С ОЛИГО 1УКЛЕОТИДНЫМИ ДУЛЕКСАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ 2АМИНОПУРИН
4.3.1. Выворачивание основания мишени модификации из ДНК
в процессе взаимодействия с Т4Пат.
4.3.2. Влияние АбоМе1 и его аналогов на связывание Т4Пат
со специфической ДНК.
4.3.3. Димеризация Тат в условиях избытка фермента
над субстратной ДНК.
4.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Измерение интенсивности флуоресценции в режиме остановленной струи. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Дизайн олигодезоксирибонуклсотидных субстратов. Метилирование 4 МТазой дефектных олигонуклеотидных дуплексов при различных температурах. Стационарные кинетические параметры метилирования канонических и дефектных субстратов. Эффект введения в участок узнавания модифицированных пуриновых оснований. Измерение скоростей метилирования при одновременном варьировании концентраций субстратов. Анализ альтернативных моделей кинетического механизма действия Таш. ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ Таш МТАЗЫ С ОЛИГО Т4Пат. ДНК. ДНК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. МТаза, М. Ферментативный перенос ДНКметилтрансферазами метильной группы от донора 8аденозилЬметионина в определнное положение основания в пределах специфической последовательности ДНК является наиболее распространнной формой биологической модификации ДНК, обнаруженной у представителей практически всех основных биологических групп, от вирусов и архсбактсрий до растений и млекопитающих. Сайтспецифическое метилирование может рассматриваться как средство увеличения информационной мкости ДИК и вовлечено в широкий спектр биологических процессов. У прокариот метилирование ДНК служит для защиты хозяйского генома от действия эндонуклеаз рестрикции и участвует в процессах регуляции экспрессии генов, репликации и репарации ДНК 14. Недавно обнаружено, что метилирование аденина в сайтах 5АТС3 бактериального генома контролирует патогенность ряда штаммов ii 5, ii i 6 и ii iiii 7. У высших эукариот метилирование цитозина богатых участков генома является обратимым регуляторным сигналом 8, связанным с такими процессами как репликация и репарация ДНК, формирование структуры хроматина, генетический импринтинг и инактивация Ххромосомы, регуляция экспрессии генов, дифференциация клеток и канцерогенез 9. В последние годы проблема биологического метилирования ДНК приобретает вс большую актуальность. Многообразие аспектов метилирования ДНК вызвало к жизни целый ряд направлений исследований таких, как Метилирование и рак, Метилазный контроль репликациитранскрипции и другие. ДНК. Наиболее пристальный интерес исследователей, благодаря сравнительной простоте организации, высокой сайтспецифичности, а также большому количеству и доступности клонированных и выделенных ферментов, привлекают метилтрансферазы II типа, кодируемые многими прокариотами и некоторыми бактериофагами 3,4. Целью настоящей работы являлось исследование механизма сайтспецифического действия ДНКметилтрансферазы, кодируемой бактериофагом Т4. Данный фермент 4 относится к Хгруппс аминоМТаз II типа и катализирует метилирование экзоциклических 6аминогрупп аденинов иалиндромной канонической последовательности 53 в цитозин, 5метилцитозин и 5гидроксиметилцитозинсодержащих двуцепочечных ДНК . С низкой эффективностью 4 способна метилировать также неканонические последовательности вида , где цитозин или тимин ,. Важно отметить, что из более чем ферментов схгруппы, известных на сегодняшний день, половина является специфическими изошизомерами, что, наряду с высокой гомологией аминокислотных последовательностей, может диктовать сходство их пространственных структур и механизмов действия. Более того, значительный уровень гомологии первичных структур, включая наиболее вариабельные участки, ответственные за взаимодействие со специфическим сайтом ДНК, демонстрируют до ферментов группы, узнающих частично перекрывающиеся последовательности , , и САТСС . В году получена пространственная структура комплекса вАТСспецифичной М. ОрпМ с , с другой стороны, проведены обширные биохимические исследования свойств ОАТАТСспсцифичной М. ЖУ . Ьметионина, на процесс взаимодействия Тат со специфической ДНК. ДНКметилтрансферазы осуществляют перенос метил Рисунок 2. Схематичное представление реакций, катализируемых ДНКметилтрансферазами.