5S pPHK-белковый комплекс THERMUS THERMOPHILUS: участки связывания белков L5 и L18 на 5S pPHK и пространственная структура комплекса белка L5 со специфическим фрагментом PHK

• Автор: Передерина, Анна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 111 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Взаимодействия рибосомных

белков с рРНК

1. Структура рибосомных РНК.

1.1. Би8рРНК.

1.2. бБрРНК

2. Структурная организация рибосомных белков

3. Взаимодействия в рРНКбедковых комплексах

3.1. Пространственная структура комплекса белка Ь со

специфическим фрагментом 8 рРНК.

3.2. Пространственная структура комплекса белка ТЬ5 со
специфическим фрагментом 5Б рРНК
3.3. Пространственная структура комплекса белка Б
со специфическим фрагментом 8 рРНК
3.4. Пространственная структура комплекса белка Б
со специфическим фрагментом Б рРНК
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Материалы
1.1. Методы.
2.1. Методы генной инженерии.
1.1.1. Полимеразная цепная реакция.
1.1.2. Электрофорез в агарозном геле.
1.1.3. Очистка фрагментов ДНК
1.1.4. Выделение плазмидной ДНК из небольших объемов культуры
1.1.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК из
больших объемов культуры
1.1.6. Лигирование ДНК.
1.1.7. Приготовление компетентных клеток..
1.1.8. Трансформация компетентных клеток.
1.1.9. Суиерэкспрессия генов 5 и
в клетках ii i.
1 .2. Экспериментальные процедуры, используемые
при работе с белками
1.2.1. Электрофорез в ПААГ.
1.2.2. Методика выделения белков 5 и
из штаммов су пер продуцентов
1.2.3. Выделение белка 5 из рибосом i i.
1.2.4. Спектроскопические исследования белков
1.2.5. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле
1.3. Экспериментальные процедуры при работе с РНК
1.3.1. Электрофорез в денатурирующих условиях
1.3.2. Электрофорез в неденатурирующих условиях
1.3.3. Выделение 5 рРНК из рибосом . i
1.3.4. Мечение 5 рРНК по 3концу.
1.3.5. Ограниченный гидролиз РНКазой А изолированной
5 рРНК и в комплексе с белками 5 и .
1.3.6. Транскрипция РНК i vi.
1.3.7. Выделение н. фрагмента 5 рРНК
из транскрипционной смеси
1.4. Кристаллизация белка 5 Т. i и
РНКбелковых комплексов.
1.5. Подготовка кристаллов комплекса к сбору
дифракционных данных
1.6. Получение тяжелоатомных производных
кристаллов комплекса 5.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Экспрессия генов белков 5 и Т. i в клетках . i.
1.1. Приготовление экспрессирующего вектора
для гена белка 5 Т. i.
1.2. Выращивание клеток штаммовсуперпродуцентов.
2. Выделение рекомбинантных белков
5 и . i.
3. Физикохимические характеристики
белков 5 и . i
4. Изучение РНКсвязывающих свойств
белков 5 ИЛ8 . i.
4.1. Определение участков5Б рРНК, защищаемых белками
5 и от гидролиза РЫКазой А.
4.2. Фрагмент 5 рРНК . i, специфически взаимодействующий
с белком 5 Т. i.
5. Кристаллизация белка 5 Т. i и его комплекса с РНК.
6. Получение тяжелоатомных производных.
7. Сбор дифракционных данных и определение
начального набора фаз
8. Структура комплекса белка 5 Т. i с фрагментом
5 рРНК . i при разрешении 2.5 А.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кристаллы комплекса белка с фрагментом 5 рРНК . i . и определить структуру данного комплекса с разрешением 1. i, . Известно, что РНКбелковыс комплексы из экстрсмофилов обладают большей стабильностью по сравнению с их аналогами из мезофилов, и поэтому более удобны для изучения и кристаллизации. По этой причине в качестве объекта исследований нами был выбран 5 рРНКбелковый комплекс из экстремального термофила Т. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействий рибосомных белков 5 и Т. рРНК. 5 и Т. 5 и Т. РНК. рРНК, специфически связывающего белок 5. 5 со специфическим фрагментом 5 рРНК. Ранее в нашей группе были идентифицированы два 5 рРНКсвязывающих белка из Т. 4 и 5 . Было установлено, что белок 4 является гомологом 5 рРНКсвязывающего рибосомного белка 5 Е. . 5 гомолог . v . рРНКсвязывающий белок, гомологичный белку . Т. ii. В данной работе были получены штаммысуперпродуценты для рибосомных белков 5 и Т. Для этих рекомбинантных белков были разработаны методики получения высокочищенных препаратов. Полученные белки 5 Т. 5 и I8 Т. были сравнены по подвижности в двумерном гсльэлектрофорезе с рибосомными белками субчастицы Т. . Таким образом, после проведения данной работы удалось показать, что 5 рРНКсвязывающий белок . ТЫ 8 в рибосомах Г. Одним из традиционных подходов для поиска сайта связывания белка на РНК является метод сравнительного ферментативного гидролиза РНК в изолированном виде и в комплексе с белком. Используя данный подход было показано, что белок 8 защищает район спирали II , а белок 5 район петли С СС 5 рРНК от гидролиза РНКазой А. На основании полученных данных был сконструирован и синтезирован транскрипцией i vi фрагмент РНК длинной нуклеотида н. III и петлю С 5 рРНК. Было показано, что этот фрагмент РНК специфически связывает белок 5. Был проведен поиск условий кристаллизации и получены кристаллы белка 5 в изолированном состоянии и в комплексе с н. рРНК. Показано, что присутствие в кристаллизационном растворе существенно улучшает качество кристаллов комплекса. Получены кристаллы комплекса н. рРНК с белком , содержащим селенометионин вместо метионина. Данные кристаллы отражали рентгеновские лучи с разрешением до 2. и были использованы для определения структуры комплекса. Структура комплекса 5 была определена совместно с группой структурных исследований рибосомных белков С. В. Пиконова Институт белка РАН, Пущино. Специфическое взаимодействие нуклеиновых кислот с белками лежит в основе многих процессов в клетке. В зависимости от функций известно несколько типов РНК транспортные РНК тРНК, информационные РНК иРНК, рибосомные РНК рРНК, рибозимы, малые ядерные РНК и малые цитоплазматические РНК. Были обнаружены также РНКсодержащие вирусы. Белки, специфически взаимодействуя с РНК, стабилизируют ее структуру, упаковывают или принимают участие в транспорте РНК. РНП, ii , двуцепочечный РНКсвязывающий мотив ii i , олигонужлеотидолигасахарид связывающий мотив iiii и некоторые другие мотивы см. i, . Однако, вопрос как происходит взаимодействие между белками и РНК в пространстве на атомарном уровне оставался открытым. Только сейчас с определением структур рибосомных субчастиц и отдельных рРНКбелковых комплексов, появилась первая детальная информация о том, как белки узнают и связываются со специфическими участками РНК. Структурная организация молекул РНК гораздо более вариабельна, чем молекул ДНК. Чем же отличаются РНК и ДНК В РНК углеводный компонент представлен рибозой, а в ДНК 2дезоксирибозой. На свойствах фосфодиэфирных связей сильно сказывается наличие или отсутствие ОНгруипы при С2атоме рибозы. ДНК содержит следующие гетероциклические основания аденин, гуанин, тимин и цитозин.