Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных

• Автор: Ходарович, Юрий Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

1. КРАТКИЙ ОБЗОР СОВРЕМЕННЫХ СИСТЕМ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ИХ РЕИМУЩЕСТВ И НЕДОСТАТКОВ
2. СРАВНЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ ТРАНСГЕННОГО ЖИВОТНОГО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

3. ПРОЗВОДСТВО РЕКОМБИНАН ТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ МОЛОКА ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

3.1 Структура типичного эукариотического гена

3.2 Районы прикрепления ДНК к ядерному матриксу элементы

3.3 Энхансеры

3.4 Регуляторные элементы генов белков молока

3.4.1 Промоторные области генов, экспрессирующихся в молочной железе во время лактации

3.4.2 Сайты гипсрчувствительности к нуклсазам

3.4.3 Последовательность i x

3.4.4 Последовательность

3.4.5. Связавание ядерных факторов с иромоторными областями генов белков молока
3.5 Экспрессия экзогенов в молочной железе трансгенных животных
3.5.1 а антитрипсин человека
3.5.2 Фактор свертываемости крови IX человека
3.5.3 Урокиназа человека
3.5.4 Тканевой плазмииогенный активатор человека
3.5.5 Сывороточный альбумин человека .
3.5.6 рохимозин крупного рогатого скота
3.5.7 Белок С человека
3.5.8 Фибриноген человека
3.6 Стабильность рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных
3.7 Способы промышленной очистки рекомбинантных белков из молока
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 ИСПОЛЬЗОВАННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
2 ПЛАЗМИДЫ И ШТАММЫ
3 ПРАЙМЕРЫ
4 СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
5 ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОИНСТРУМЕНТОВ ДЛЯ МИКРОМАНИПУЛЯЦИЙ С ЗИГОТАМИ
5.1 Приготовление микроинъекционных пипеток
5.2 Приготовление удерживающих пипеток
5.3 Приготовление пипеток для трансплантации и переноса зигот
6 ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
6.1 Получение трансгенных мышей
6.1.1 Анестезия мышей
6.1.2 Вазэктомия самцов мышей.
6.1.3 Подготовка реципиентных ложнобсрсмснных самок для трансплантации зигот
6.1.4 Получение беременных самок
6.1.5 Проведение супсровуляции
6.1.6 Получение зигот от донорных мышей
6.1.7 Проведение микроинъекций
6.1.8 Трансплантация зигот
6.2 Получение трансгенных кроликов
6.2.1 Проведение гормональной подготовки кроликов доноров зигот
6.2.2 Извлечение зигот у кроликов
6.2.3 Проведение микроинъекций
6.2.4 Трансплантация микроинъецированных эмбрионов
7 АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
7.1 Выделение высокомолекулярной геномной ДНК солевым методом
7.2 Проведение ПЦР
7.3 Доение животных
7.4 Обезжиривание молока
7.5 Электрофоретическое разделение белков молока
7.6 Подготовка образца для массспектроскопического анализа
7.7 Обессоливание на микроколонке и снятие массспектра
7.8 Определение ин гсрфероновой активности
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ,
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ В МОЛОКЕ БЕТАИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕКА
1.1 Создание гибридного гена ВЕОЫЯМЬ
1.2 Получение трансгенных кроликов, содержащих гибридный ген ВГХЗЫЕКЬ
1.3 Анализ наследования и тканеспецифичности экспрессии габридного гена ВШМКЫЬ
1.4 Определение биологической активности ИФНбета в молоке траисгенных крольчих поколений Р1 и Г2
1.5 Изучение изменений в белковом составе молока трансгенной крольчихи
2 ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ КОИНТЕГРИРОВАННЫЕ ГЕНЫ ВГХН1ГИВ И БАЯЕМН
2.1 Создание гибридной конструкции, содержащей генетические элементы, повышающие экспрессию генов
2.2 Получение мышей, трансгенных но бетаинтерферону и конструкции БАЯ
2.3 Анализ наследования трансгенов в поколении Я1
2.4 Анализ ориентации трансгенов в интегрированном состоянии
2.5 Анализ белкового состава молока мышей
2.6 Изучение тканеспецифичности экспрессии бетаинтерферона у трансгенных мышей
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ. СОСТАВ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД, РАСТВОРОВ И БУФЕРОВ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение


Целью работы было создание трансгенных животных, продуцирующих бетаинтерферон человека в молоке, и изучение закономерностей экспрессии введнных генов. Создание технологии промышленного производства рекомбинантных белков РБ эго сложный многостадийный процесс, который включает создание собственно штамма продуцента, удовлетворяющего многочисленным требованиям, разработка технологий ведения культуры, создание систем мониторинга параметров производственного процесса и контроля качества получающегося препарата. Так, в настоящее время создание или даже расширение производства на основе культуры эукариотических клеток мкостью около 0 литров требует от трх до пяти лет и затрат от 0 до 0 миллионов долларов. Основными денежными затратами являются затраты на оборудование контроля процесса, разработку систем анализа и на системы контроля качества. При этом очень важным этапом на пути препарата к рынку является одобрение технологии производства контролирующими органами, которые требуют обеспечения стабильности технологического процесса и биобезопасности полученного продукта. Разработать технологический процесс, отвечающий этим требованиям сравнительно легко при применении ранее использованных и одобренных технологий производства белков т. Это объясняет тот факт, что новые технологии производства белков, появившиеся в последнее время, такие как использование трансгенных животных и растений, вс ещ не используются в биофармацевтической промышленности, несмотря на экономическую привлекательность. Если посмотреть на список одобренных в году в Европе и США биофармацевтических препаратов таблица 1, то видно, что все они получены с использованием клеток . СНО и . Среди других продуцентов РБ, кроме трансгенных животных, стоит отметить клетки насекомых и трансгенные растения. Достоинства и недостатки этих систем получения РБ кратко рассматриваются ниже. I i i . IIX пжаэмлНп i . ЫпМ, . I . V vxi V v. I1 iii i 1. I3 i I i i 3. Таблица 1. Список биофармацевтических препаратов, одобренных к применению в году в США и Европейском Союзе. Бактерии как правило К. Преимущества многочисленные случаи использования для производства РБ, хорошо известная генетика организма, легко и дшево выращиваемые клетки, дешвая среда для роста, достижение высоких уровней экспрессии очень быстро иногда в течение 5 дней, быстрорастущие клетки. Недостатки белки, как правило, не секретируются таким образом, требуется этап разрушения клеток, что затрудняет сбор материала для очистки, содержит эндотоксины, микрогетерогенны, отсутствуют иосттрансляционные модификации, вероятность неправильного фолдинга белка, при выделении из клеток белок может повреждаться. Примеры препаратов, получаемых из бактерий инсулин компании i i первый препарат, одобренный с использованием технологии рекомбинантной ДНК. I., использует . Другие компании используют . Преимущества обычно воспринимаются как безопасные регулирующими органами, долгая история использования, хорошо понятная генетика, высокие уровни экспрессии достигаются довольно быстро от 2 до 8 недель, белок секретируется для удобного сбора, быстро растут, недорогая среда, белки обычно правильно сврнуты, есть посттрансляционные модификации. Примеры препаратов, получаемых из дрожжей Сотни лет . Дрожжи используются для производства вакцин, например, против гепатита В. Гак же дрожжи используются для получения инсулина человека. Стоимость производства белка с использованием дрожжей обычно составляет от до 0 долларов за грамм конечного продукта. Преимущества наличие посттрансляционных модификаций, правильно свернутый белок, белок секретируется, довольно высокий уровень экспрессии, высокий уровень экспрессии достигается довольно быстро в течение 4 недель, бакуловирусы безопасны для человека. Недостатки малое время использования клеток насекомых для экспрессии и очень маю примеров одобрения регуляторными органами, медленно растут, дорогая среда для роста, инфекция бакуловирусом это дополнительный этап в технологическом процессе, содержит иммуногенные белки клетки хозяина, иногда некорректное гликозилирование, вирусы млекопитающих могут инфицировать клетки в тплых культурах.