Роль А и В флагеллинов в формировании жгутика галофильного археона Halobacterium salinarum

• Автор: Тарасов, Валерий Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Жгутики Архсй.

1.1 .Морфология и функция.

1.2. Субъсдиничный состав.

1.3.1 ены флагеллинов.

1.4. Улыраструкгура нити жгутиков и доменная организация флагеллинов.

1.5. Роль флагеллинов в структуре нити и гипотетическая модель сборки жгутиков.

2. Краткая характеристика жгутиков бактерий.

3. Краткая характеристика бактериальных пилен IV типа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. МАТЕРИАЛЫ
1.1 .Химические реагенты и ферменты.
1.2. Буферы и другие растворы использованные в работе.
1.3. Среды.
1.4. Бактериальные штаммы.
1.5. Плазмиды.
2. МЕТОДЫ
2.1. Методы работы с ДНК.
2.1.1. Выделение плазмидной ДНК из малых объемов культуры.
2.1.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК из больших объемов культуры.
2.1.3. Выделение хромосомной ДНК Я. яаНпагит.
2.1.4. Полимеразная цепная реакция.
2.1.5. Рестрикция ДНК.
2.1.6. Электрофорез в геле агарозы.
2.1.7. Очистка фрагментов ДНК.
2.1.8. Дсфосфорнлированис 5 концов ДНК.
2.1.9. Лигирование ДНК.
2.1олучение компетентных клеток Е.соН.
2.1 Трансформация компетентных клеток Е.соН плазмидной ДНК.
2.1 Трансформация клеток Н.заНпагит.
2.1 Приготовление меченого зонда.
2. нбридизация по Саузерну.
2.1 Определение первичной структуры ДНК.
2.2. Методы работы с РНК.
2.2.1. Выделение суммарной РНК из клеток Н. мпагит.
2.2.2. Электрофорез РНК.
2.2.3. Нозернгибридизация.
2.3. Экспериментальные процедуры при работе с белками.
2.3.1. Электрофорез в ДСНПААГ.
2.3.2. Выделение жгутиков.
2.3.3. Идентификация глпкопротеинов.
2.3.4. Определение молекулярных весов.
2.3.5. Определение концентрации белка.
2.3.6. Протсолиз.
2.3.7.1 олученнс поликлональных антител.
2.3.8. Иммуноблоттинг.
2.3.9. Электронная микроскопия.
2.3 Микрокалориметрнческис исследования. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Определение роли А или В флагеллннов И. жИпагит с использованием методики нокаута генов.
1.1. Получение мутантных штаммов запагити1К с инактивированным синтезом всех А и В флагеллинов, соотвественно.
1.2. Получение мутантного штамма Н. запагитА2 с
инактивированным сшпезом А2 флагеллина.
1.3. Характеристика мутантных штаммов Н. запагит.
2. Исследование доменной организации флагеллинов Н. заИпапип.
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
С ИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ДСП долепил сульфат натрия МБАЫ ыегилснбисакриламид ПААГ полиакриламидный гель ПСА персульфат аммония ПЭГ полилтилснгликоль ТЕМЕДЫ4.М,Ггеграметилэтилендиамин Трнс трисгилрокснмстил аминомстан ЭДТА эти лен диамин тетраацетат с глюкоза
сА глюкуроновая кислота т. п. н. тысяча пар нуклеотидов а.о. аминокислотные остатки
ВВЕДЕНИЕ


В то же время им присущи как типично эукариотические свойства, так и уникальные, характерные лишь для представителей данной группы Пранппнвили, . С момента их открыта считалось, что жгутики у данных организмов аналогичны бактериальным. Первое сомнение возникло, когда была определена первичная структура флагеллинов i i ранее i i I1. Дальнейшие исследования жгутиков архей выявили у них ряд существенных отличии от жутнков бактерий. У архей жгутики тоньше бактериальных в два раза и, повидимому, не имеют полого канала вгугри. Их сборка, по косвенным данным, осуществляется с проксимального, а не с дистального конца как у бактерий . Жгутики архей всегда составлены из набора различающихся флагеллинов при диссоциации распадаются на ирогофиламенты. Л0 . Пятнбратов и др. Флаге. Совокупность приведенных данных позволила отнести жгутики архей к отдельному, отличному от бактериальною, аппарау жутиковой подвижности . Однако на сегодняшний день нет ясною представления о процессе сборки жгутиков архей и механизме формирования их спиральной ультраструктури. Главная причина этого кроется в неопределенности функций различных флагеллинов. I, МАР2, НАРЗ белки присутствуют в минорных количествах. Спиральноегь нити жгутика бактерий обусловлена способностью флагеллина принимать две конформации ii, , i, . У архей, как уже было отмечено, жгутик состоит из набора различающихся флагслииов. Какие из белков являются белками нити жутика, определяя его спиральную форму, а какие иракл возможно иную роль в сборке жгутика не известно. Ситуация представляется еще более запутанной при учете того, что для разных архей количество белков, отнесенных к флагеллинам, колеблется от трех до пяти. Нами было выдвинуто предположение, согласно которому спирализация нити жгутика архей обеспечивается ассоциацией иротофнламентов различающейся длины. Протофиламснты при этом должны состоять из одного флагеллина. Для i ii было показано, что, по крайней мере, один из флагеллинов образует отдельную протофиламенту. Соответственно, для формирования спирального филамеига необходимо, как минимум, два флагеллина, являющихся аналогами двух конформаций бактериального флагеллина i, . В случае сборки из одного флагеллина жгутик должен бы быть прямой. Основной задачей представленной работы было выяснение роли А и В флагеллинов А1, А2. В1. В2, ВЗ i i в формировании нити жгутика. Проверялось выдвинутое нами предположение о механизме спирализацмн нити жгутиков архей. А и В флагеллинов. Исследовалась доменная организация флагеллинов у штамма дикого типа и. Детальное изучение жгутиков архей в настоящее время проводится на представителях двух групп метаногенах v, и экстремальных галофилах i i ранее i i. Разротненая информация по другим штаммам ix, ii, . Клетки Н. М. v, М. М. i, . На стационарной фазе у клеток Я i, а также у А i на всех фазах возможна амфитрихиальная локализация. Во всех случаях ниш жгутиков образуют пучок, вращение которого создаст гидродинамическое усилие, приводящее клетку в движение. В пучок входит от 5Ю нитей у П. А. i . М. ii . У Я. Параметры спирали и толщина нити имеют близкие значения среди рассматриваемых архей таблица 1. В сравнении с бактериями нити жгутиков архей значительно тоньше нм нм у бактерий. Я. i относится к одной из особенностей архей, так как для бактериальных жтугиков в норме характерна левозакрученная спираль. На стационарной фаге роста у нптаммма Н. Таблица 1. Организм длина нити. М. i 9. М , 7. Н. i 4 9. М . Образование значительною количества у данного штамма, повидимому, связано с уменьшением степени гликозилирования флагеллинов приводящего к усилению агрегации жгутиков i i, . Полиморфизм жгутиков архей был отмечен в единственном случае. У Я i при изменении в образцах содержащих как , так свободные жгутики таблица 2 . Уменьшение до 2,4 приводило к образованию прямых форм при увеличении до 9,2 9,5 появлялись формы при ,5 присутствовали кольцевые формы. Во всех приведенных случаях изменений направления спирали не происходило. В соответствии с направлением спирали, для И.