Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+

• Автор: Махортова, Нина Руслановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Вирус кори как возбудитель нейротропной инфекции

1.1 Корь, история и истоки заболевания

1.2 Структурная организация частицы вируса кори и жизненный цикл

1.3 Клеточные рецепторы вируса кори и пути заражения

1.4 Вирусная персистенция в ЦНС и ассоциированные заболевания.

1.5 Заболевания ЦНС, ассоциированные с персистенцией ВК.

1.6 Особенности заболевания подострого склерозирующего панэнцефалита ПСПЭ

Глава 2. Модельная система заболевания ПСПЭ.

2.1 Трансгенные мыши являются восприимчивыми к заражению ВК

2.2 Заражение вирусом кори ЦНС i viv и i vi не приводит к гибели нейронов
2.3 Отсутствие классического распространения ВК между нейронами, вирусные титры в культуре, проблемы почкования и формирования синцития
2.4 Распространение ВК между нейронами происходит через синапс и является С6независимым
Глава 3. Ингибиторы слияния ВК с клетками.
3.1 Механизмы слияния вирусов использующих гликопротсин белок
слияния.
3.2 Особенности процесса слияния ВК с клеткой.
3.3 Слияниеингибирующий пептид СИП, воздействие на различные вирусы и предполагаемый механизм действия
3.4 Представители семейства нейротахикининовых пептидов НТП субстанция П,
нейрокининА, нейрокининБ ингибируют распространение ВК в нейронах
Глава 4. Рецепторы нейротахикининовых пептидов НТП
Строение, экспрессия, сигнальная трансдукция и физиологические функции рецепторов семейства нейротахикининовых пептидов НК1, НК2 и НК3
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Вирусы.
2. Клетки.
3. Животные и их геногипирование
4. Белковый электрофорез и вестерн блоггибридизация
5. Иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция
6. Мсчение клеток прижизненными флуоресцентными красителями.
7. Иммуногистохимия срезов мозга мышей
8. Метод оценки смешения цитоплазмы в области синаптических соединений
9. Ингибиторный анализ инфекции ВК в клеточной культуре.
. Эксперименты по заражению мышей.
. Сбор образцов тканиклеток для выделения РНК, выделение РНК.
. Анализ РЖ методом ОТПЦР
. РНК дотблот гибридизация.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Безрецепторное распространение ВК является уникальным для нейронов
2. Экспрессия и распределение белка слияния БС в нейронах заражнных ВК
Фрагменты БСо и БС экпрессируются в заражнных нейронах
Белок слияния ВК экспрессируется в заражнных нейронах наряду с другими
вирусными протеинами
Белок слияния В К локализуется в отростках и синапсах заражнных нейронов .
3. Слияние мембран у заражнных ВК нейронов по типу синцития в синапсах
4. СИП блокирует заражение и распространение ВК в культуре первичных
нейронов
СИП предотвращает распространение ВК между первичными
нейронами.
Способность СИП ингибировать распространение ВК является дозозависимой. СИП специфически ингибирует распространение ВК в культуре чувствительных
нейронов
СИП предотвращает заражение ВК v в первичных нейронах.
5. Нейротахикининовые пептиды НТП ингибируют распространение ВК между
нейронами.
Последовательность аминокислотных остатков использованных пептидов
Влияние нейропептидов на распространение инфекции В К,
6. Рецептор субстанции П НК1 участвует в распространении ВК между нейронами
в первичной культуре и в мозге заражнных мышей.
График выживания новорожднных мышей трх генотипов СПУ, СВ4Г7НКI КО и дикого типа после зараясения В К.
Сравнительный анализ заражения ВК методом ОТПЦР РНК выделенной из мозга СОНКГ или С6НК1 КО новорожднных мышей на 6ой день после заражения ВК
Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии С НК1КО ВК, не могут быть заражены вирусом кори иммуногистохимия.
Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии С6Л НК1К0 ВК, не могут быть заражены вирусом кори ОТПЦР.
Влияние апрепитанта на лечение мышей заражнных ВК
Анализ заражения ВК СОтКА0 КО мышей в присутствие и в отсутствии НК1 антагониста Апрепитант иммуногистохимия.
Анализ заражения ВК С6РЛ 7 КО мышей в присутствие и в отсутствии НК1 антагониста Апрепитант РНК дот блотгибридизация
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Образование синцития происходит за счт взаимодействия вирусных гликопротеинов, экспрессированных на поверхности заражнных клеток с рецепторами на незаражнных клетках , . Вирус кори способен заражать лишь клетки человека, содержащие поверхностные белки и , исполняющие роль рецепторов к этому вирусу. Так как молекулы и есть лишь у клеток приматов и отсутствуют у других животных, то, до недавнего времени, только приматы могли быть использованы как экспериментальные животные для изучения, патогенеза ВК в ЦНС, включая редкое смертельное заболевание ЦНС ПСПЭ i , . Отсутствие достаточно дешвых доступных животных моделей существенно затрудняло исследование заболеваний ЦНС, индуцируемых корью. Изучение механизмов патогенного действия ВК в тканях мозга стало возможным благодаря созданию трансгенных животных моделей Поскольку в природе мыши не являются восприимчивыми к заражению ВК, то для изучения патогенеза ПСПЭ i viv в году создали и охарактеризовали первую трансгенную мышиную модель вирусной инфекции клеток нервной системы. Мыши линии экспрессируют молекулы человека, являющиеся рецепторами к ВК под контролем специфического для нейронов промотора нейронспецифической енолазы НСЕ. Таким образом, только мозг трансгенных мышей является восприимчивым к заражению ВК, поскольку рецептор экспрессируется исключительно в нейронах ЦНС i , , . ВК интенсивно распространяются между клетками. При этом нейроны не погибают, и монослой клеток сохраняет свою структуру при любых вирусных титрах и плотности посева клеток. Также было показано, что рецептор необходим лишь для первичного проникновения ВК в нейроны, тогда как дальнейшее распространение вируса происходит через синапс и не зависит от наличия рецепторов или , . Таким образом, распространение вируса между нейронами протекает по особому механизму, отличному от пути его изначального проникновения в клетку. Межнейроиальное распространение ВК в отсутствие рецептора или может происходить за счт взаимодействия гликопротеинов оболочки вируса с дополнительными поверхностными молекулами клетки, ещ не идентифицированными в качестве рецепторов к ВК i К , М , . Также не исключено, что эти рецепторы могут связываться с поверхностным гликопротеином ВК, отличным от ГА, например с БС i К , . Считают, что процесс слияния частицы ВК с мембраной клетки требует затраты энергии, источниками которой могут являться конформационные изменения ГА, повышение температуры, или взаимодействие БС со своим собственным рецептором на клетке , , . Данные о траиссинаптической и независимой передаче ВК между нейронами, указывают на то, что взаимодействие ГА с его рецептором в области синапса не требуется , . Это привело нас к постановке ряда задач по исследованию роли второго гликопротеина вируса кори БС в нейротрансмиссии. Синтетический трипептид X назвали слияниеингибирующим пептидом СИП. По результатам этих работ предположили, что СИП взаимодействует с предполагаемыми рецепторами на клеточной мембране, и подавление заражения осуществляется за счт конкуренции с БС за эти рецепторы i i , . Представители семейства нейротахикининовых пептидов НТП субстанция П СП, иейрокининА НКА и нейрокининБ НКБ в активном центре также имеют аминокислотную последовательность X, присутствующую в пептидах СИП и на конце белка слияния ВК. В экспериментах проведнных на фибробластах, впервые было показано, что СП обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был невыяснен. Объясняя механизм такой антивирусной активности основывались том, что последовательность трх аминокислотных остатков активного центра субстанции П является гомологичной последовательности остатков аминокислот синтетического трипептида СИП и конца белка слияния ВК. В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идт конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК является рецептор нейрокинин 1 НК1 С, . Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение роли молекулы НК1 в процессе транссинаптической передачи ВК между нейронами ЦНС.