Анализ первичной структуры гена ribR Bacillis subtilis и основные характеристики соответствующего полипептида

• Автор: Соловьева, Ирина Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1. Биосинтез рибофлавина

1.2 Аналоги рибофлавина и их регуляторная активность.

2. Генетика, первичная структура и организация структурных генов биосинтеза рибофлавина .ii

3. Биосинтез флавокоферментов флавннмононуклеотида и

ф л а в и а ден ин д и ну клеотада

3.1 Химические свойства флавинов.

3.2 Синтез ФМН и ФАД в клетке

3.3 Особенности превращения рибофлавина у .ii.

4. Регуляция флавиногенеза у i i
4.1 Структура регуляторной области рибофлавинового
оперона .ii.
4.2 Особенности гена i
4.3 Группа i мутаций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клонирование гена i и изучение его функций.
2. Рестрикционное картирование вставки, несущей i ген.
3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности
фрагмента ДНК, содержащего ген пЬЯ
4. Идентичен ли клонированный фрагмент соответствующему
фрагменту хромосомы
5. Субклонирование и биохимическая идентификация продукта
гена пЬЯ
6. Изучение свойств флавокиназы
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


О функциях генов могут быть высказаны предположения на основе гомологии с ранее идентифицированными белками, однако, экспериментально определенными являются только всех генов i ii. , . Поэтому, идентификация неизвестных ранее генов i ii и изучение свойств их белковых продуктов являются интересными и важными задачами. Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение системы флавиногенеза у i ii. К началу настоящей работы теория регуляции системы флавиногенеза i i пополнилась рядом новых данных, не укладывавшихся в существовавшую ранее схему регуляции подробнее в разделе Обзор литературных данных. Было высказано предположение, что регуляторная система рибофлавинового оперона не ограничивается геном регулятором i и регуляторной зоной, так как была обнаружена третья группа мутаций, обозначенных как i5 Кренева Р. А. Перумов Д. А, . i5 мутанты проявлялись в штаммах, продуцировавших рибофлавин за счет мутации в гене i. Сохраняя в хромосоме исходную мутацию i С, i5 мутанты полностью утрачивают свсрхсинтез рибофлавина, и в этом смысле, безусловно, имеют отношение к регуляции рибофлавинового биосинтеза. К началу настоящей работы это было все, что известно о новой группе мутаций. Клонирование и рестрикционное картирование фрагмента хромосомы, содержащего i ген и изучение функций i в клетках В. Субклонирование и экспрессия гена i в клетках Е. Определение основных характеристик пептида, кодируемого геном i. Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе был клонирован неизвестный ранее в системе флавиногенеза у i ii ген i. Была опрелелена нуклеотидная последовательность этого гена. На основании гомологии белкового продукта клонированного гена i с ранее изученными белками, была предположена его функция монофункциональной флавокиназы. Ген i был субклонирован и экспрессирован в . Полученный обогащенный белком i экстракт был тестирован в реакциях i vi. Были определены основные характеристики i белка. Клонирование, идентификация и изучение свойств нового для системы флавиногенеза i ii белка монофункциональной флавокиназы не только вносит свой вклад в изучение фундаментальных проблем, но и дает возможность применения полученных знаний для решения прикладных задач таких как производство промышленно важных метаболитов, включая и те, что в настоящий момент производятся химически рибофлавина, ФМИ и ФАД. Л Биосинтез рибофлавина. Исследования реакций биосинтеза рибофлавина проводились уже более чем лет и лишь относительно недавно были обобщены в представленную на рис. Путь биосинтеза рибофлавина одинаков у грамположительных и грамогр и нательных бактерий i . . Рего, . Согласно общепринятой на данный момент схеме биосинтез осуществляется в пять стадий. Предшественником рибофлавина служит гуанозин5трифосфат ГТФ. На первой ступени иод действием фермента ГТФциклогидролазы II из имидазольного кольца ГТФ удаляется углерод С8. Реакция сопровождается освобождением пирофосфата и приводит к образованию формиата и 2,5диамино6рибозиламино4НЗпиримидинон5фосфата 2. За этой реакцией следует гидролитическое дезаминирование пиримидинового кольца, приводящее к образованию промежуточного продукта 35амино6рибозиламино2,41Н,ЗНпиримидиндион5фосфата, который затем восстанавливается с образованием 5 амино брибитиламино 2, 4 1Н, ЗН пиримидинодион 5 фосфата соединение 4. На следующей ступени происходит включение четырехуглсродного фрагмента, донором которого является рибулозо5фосфат или его метаболит с образованием птеридина 6,7диметил8рибитиллюмазина 7. Перед включением в птеридин 7 пиримидиновый интермедиат 4 подвергается дсфосфорилированию. На последнем этапе две молекулы 6,7диметил8рибитиллюмазина при участии рибофлавинсинтазы реагируют между собой с образованием рибофлавина 8 и 5амино6рибитиламино2,41К,ЗНниримидиндиона.