Идентификация генов человека, экспрессия которых меняется при инфекции вирусом клещевого энцефалита

• Автор: Гаврилов, Борис Гавриилович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ5
ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
Введение 7
Культуры клеток и объект анализа изменения экспрессии клеточных генов пул мРНК к ДНК
Исследование экспрессии клеточных генов с использованием микроматриц микрочипов ДНК

Серийный анализ генной экспрессии

Метод дифференциального дисплея

Метод вычитающей гибридизации

Подтверждение дифференциальной транскрипции

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение
Стратегия, использованная для поиска дифференциально экспрессирующихся генов в инфицированных вирусом клещевого энцефалита клетках человека
Описание метода
Селективная амплификация обогащенной фракции
Вычитающая гибридизация. Создание и анализ обогащенных кДНК библиотек
Идентификация и подтверждение дифференциальной экспрессии транскрипгов iенов I1II6
Поздняя индукция генов II и II
Разработка метода дифференциального скрининга полученных после супрессионной вычитающей гибридизации библиотек кДПК и создание высокообогащенных или упрощенных библиотек на их основе
Описание модельной системы
Исследование кинетики ренатурации фрагментов кДНК вычтенной библиотеки с целью определения условий, необходимых для удаления фоновых молекул Подход с использованием экзонуклеазы ЕхоШ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ
Оборудование и расходные материалы
Среды и растворы
МЕТОДЫ
Клетки и вирусы
Получение РНК
Электрофорез в агарозном геле
Очистка опигонуклеотидных праймеров
амптификация
Структура праймеров, используемых в амплификациях
Очистка фрагмента ДНК в агарозном геле
и блот гибридизация
Создание упрощенныхвысокобогощенных зондов и вычтенных библиотек Трансформация . i
Вычитающая гибридизация

Определение первичной структуры ДНК
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Подходы, используемые для идентификации клеточных генов, изменяющих свою экспрессию при заражении клетки вирусом, рассматриваются в этом обзоре. Изменения генной экспрессии лежат в основе разнообразия биологических программ, реализуемых различными клетками, их функций и фенотипических различий. Широкий ряд клеточных процессов, также сопровождаются изменениями в спектре экспрессии генов. Для идентификации генов, обладающих регуляторными функциями и контролирующими определенные процессы клетки, в настоящее время применяется целый ряд подходов. Среди них методы анализа генной экспрессии i vi, развиваемые в настоящее время, основанные на сравнительном анализе наборов мРНК и белков, синтезируемых функционально различающимися клетками. В эукариотической клетке экспрессируется несколько десятков тысяч различных генов, при этом только от 3 до из них экспрессируется в каждом типе клеток это так называемые i . Уровень экспрессии остальных генов различается в клетках различных типов. Дифференциальная экспрессия лежит в основе разнообразия фенотипов живых организмов, сопровождая и в значительной степени определяя все жизненные процессы. Изучение регуляции экспрессии различных генов важное направление в современной клеточной биологии. Регуляция экспрессии может осуществляться на нескольких принципиально различных уровнях регуляция транскрипции, регуляция посттранскрипционных процессов созревания и транспорта РНК, регуляция трансляции. Такие процессы как дифференцировка тканей, эмбриогенез, иммунный ответ, образование опухолей, а также регуляция клеточного цикла и разнообразные клеточные ответы на внешние воздействия и т. РНК. В основе протеомики лежит обширный комплекс методов, позволяющих разделять, детектировать, идентифицировать и количественно анализировать тысячи белков, составляющих протеом клетки. Как уже упоминалось выше, только небольшая часть потенциально активного генома транскрибируется и транслируется в определенном типе клеток, а количество РНКкопий далеко не всегда коррелирует с числом соответствующих белковых молекул . К факторам, определяющим изменчивость протеома, также следует отнести коррекцию мРНК, альтернативный сплайсинг, ко и посттрансляционные модификации и процессинг. Возможность идентификации всех вариантов белков из его предшественника первичного продукта трансляции, является важным шагом на пути понимания связи генома и фенотипа. Однако эффективность применения двумерного электрофореза в протеомных проектах в значительной степени зависит от числа белков, которые должны быть разделены из многокомпонентной смеси. Интенсивный анализ цельных клеточных экстрактов, субклеточных фракций и органелл, позволяет предполагать, что отдельные клетки за некоторыми исключениями, повидимому, синтезируют не более первичных продуктов трансляции i . Но, к этому числу необходимо добавить многочисленные варианты белков, образующиеся в результате посттрансляционного процессинга и химических модификаций фосфорилирование, гликозилирование, метилирование, ацетилирование, липидирование, сульфатирование и др. Современные же варианты двумерного электрофореза позволяют разделять и детектировать только около белков. Кроме того, существует принципиальная сложность, связанная с идентификацией полного протеома эукариотической клетки на двумерных гелях или блотах, проблема детекции белков, которые представлены в клетке очень малым числом молекул 0. Хотя содержание мРНК не окончательно определяет конечный продукт активности гена, транскрипция первый шаг в генной регуляции, и информация об уровне транскрипции необходима для понимания сетей генной регуляции. Кроме того, измерение уровня мРНК на сегодняшний день значительно дешевле и может быть проведено более высокопроцессивным путем, чем прямое измерение на протеомном уровне. Наконец, отсутствие мРНК предполагает отсутствие соответствующего белка и таким образом, по крайней мере, качественная оценка протеома может быть основа на информации но транскриптому.