Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности

• Автор: Речкина, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : 17 ил.

Оглавление
Оглавление

Список сокращений.

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Молекулярная организация вируса гепатита С

1.2 Строение и функции вирусных белков.

1.3 Особенности ВГСинфекции.

1.4 Антигенная структура белков ВГС и методы картирования

2 Материалы и методы.

2.1 Иммуногистохимическая детекция белков

2.1.1 Пациенты
2.1.2 Исход ОГС.
2.1.3 Морфологический анализ
2.1.4 Выделение МКА из асцитных жидкостей.
2.1.5 Моноклональные антитела.
2.1.6 Определение концентрации белка
2.1.7 Иммуногистохимическое ИГХ окрашивание.
2.2 Картирование антигенных детерминант белков ВГС.
2.2.1 Фаговая библиотека
2.2.2 Аффинный отбор
2.2.3 Трансдукция клеток Е.соН фагами.
2.2.4 Иммуноскрииинг
2.2.5 Выделение одноцепочечной фаговой ДПК и секвснироваиие
2.2.6 Анализ результатов секвсиирования
2.3 Изучение иммуногенности отдельных детерминант
2.3.1 Иммунизация мышей.
2.3.2 Определение активности антител в сыворотках мышей.
2.3.3 Реакция бласттрансформации спленоцитов
2.4 Изучение антигенных свойсв отдельных антигенных детерминант
2.4.1 Реакция иммуноДОТа с сыворотками больных ГС
2.4.2 Приготовление лизата .i.
2.4.3 Истощение сывороток больных.
2.4.4 Иммуноферментный анализ. Непрямой ИФА.
2.4.5 СендвичИФЛ 1.
2.4.6 СендвичИФА 2
2.4.7 Статистическая обработка результатов
3 Результаты.
3.1 Выявление натуральных антигенных детерминант в печени больных
3.2 Картирование антигенных детерминант
3.3 Изучение иммуногенных свойств отдельных детерминант
3.4 Изучение антигенных свойств отдельных детерминант
4 Обсуждение результатов.
Список цитированной литературы


Научная новизна и практическая значимость. Впервые показано, что отдельные антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в клетках печени больных ОГС с различной частотой. Наиболее часто выявляются четыре антигенных детеминанты на белках 4 и 5, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант. Установлена структурная организация 6 антигенных детерминант, не описанных ранее, в составе белков , 3, 4 и 5 ВГС. Показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, индуцируют у мышей развитие вирусспецифического гуморального ответа. Разработан лабораторный метод выявления антител у больных ГС к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах. Показано, что на ранних сроках после манифестации инфекции до 1 месяца спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции. Данный критерий может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С. Основные положения, выносимые на защиту. Установлено, что частота выявления отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках печени больных ОГС различается. В целом индивидуальные белки , 3, 4 и 5 выявляются в клетках печени 0 пациентов с острым гепатитом С. Получены фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты белков ВГС. Определены ключевые аминокислотные остатки антигенных детерминант на белках , 3, 4 и 5, участвующие в связывании с антителами, установлена конформация 6 детерминант. ВГС в составе фаговых частиц. Разработана схема детекции антител к отдельным антигенным детерминантам белков ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С с использованием фагов, несущих пептиды, имитирующие эти детерминанты т. Установлено, что у больных ОГС частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам достоверно выше по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении стадий инфицирования. Вирус гепатита С ВГС, впервые идентифицированный в г. В. Инфицирование им происходит через кровь и продукты крови, а также при парентеральном вмешательстве. Кроме того, предполагают, что вирус может передаваться через слюну и другие жидкости организма . Гепатит С переходит в хроническую форму с частотой до случаев и часто приводит к циррозу. Считают, что ВГС связан с возникновением гепатоцеллюлярной карциномы 6. Вирусная частица имеет диаметр около нм и состоит из оболочки, образованной из мембраны клеткихозяина, в которую включены кодируемые вирусным геномом гликопротеииы Е1 и Е2. Оболочка окружает нуклеокапсид с одноцепочечной РНК положительной полярности длиной приблизительно пар нуклеотидов п. Плавучая плотность частиц ВГС в градиенте варьирует от 1, до 1, гмл. Эти пределы шире, чем для остальных флавивирусов . На ранних стадиях инфицирования вирус выделяют преимущественно из фракций низкой плотности. Со временем, при переходе в хроническую стадию, плотность выделяемых вирусных частиц начинает варьировать. Некоторые исследователи объясняют эту вариабельность присутствием антител, связывающих вирусные частицы . ВГС имеет геномную организацию сходную с пссти и флавивирусами 2. ВГС относят к отдельному роду ivi в семействе vivii 0. Основываясь на филогенетическом анализе белков , и 5 8, различают шесть основных генотипов ВГС 16, которые в свою очередь подразделяют на субтипы , , 2а и т. Полипротеин процессируется с участием клеточных и вирусных протеаз с образованием вирусных белков рис. , Е2, локализованных на концевой четверти полипротеина, и неструктурных НС белков 2, 3, 4, 4, 5, 5, локализованных на оставшейся части полипротеина . На рис. Рисунок 1. Схема вирусного полипротеина и его процессинга Клеточная сигнальная пептидаза локализуется в цистернах эндоплазматического ретикулума ЭПР, катализируя расщепление структурных белков.