Молекулярные механизмы специфичности действия РНК-деполимераз

• Автор: Яковлев, Геннадий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 315 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение

2. Структурнофункциональная организация

активных центров РНКдеполимераз

Литературный обзор. II

2.1. Пиримидинспецифичные РНКазы. РНКаза А II

2.1.1. Субстраты РНКазы А и стереохимия их ферментативного гидролиза.

2.1.2. Исследование пространственной структуры комплексов РНКазы А с аналогами субстратов методом рентгеноструктурного анализа
2.1.3. Теоретические расчеты структур ферментсубстратных комплексов и анализ механизма действия РНКазы А.
2.1.4. Исследование структуры комплексов РНКазы А с аналогами субстратов методами ядерного магнитного резонанса

2.2. Гуанилспецифичные РНКазы.

2.3. Неспецифичные РНКазы.
2.4. Нуклеазы.
2.5. Природа специфичности РНКдеполимераз
3. Структура ферментсубстратных комплексов
пиримидинспецифичной РНКазы А в растворе.
3.1. Топохнмические особенности строения активного центра РНКазы А в растворе
3.2. Структура и свойства комплексов РНКазы А
с пиримидиновыми нуклеотидами
Стр.
3.3. Взаимодействие РНКазы А с пуриновыми
нуклеотидами.
3.4. Определение конформации мононуклеотидов, фиксированных в активном центре РНКазы А
3.5. Изучение конформации пиримидиновых
нуклеозид2,3циклофосфатов в фермент
субстратных комплексах.
3.6. Структура комплексов РНКазы А с динуклеозидфосфатами.
3.7. Динамика образования ферментсубстрат
ного комплекса.
3.8. Термодинамика образования комплексов
РНКазы А с нуклеотидами
3.9. Динамическая модель продуктивного ферментсубстратного комплекса.
4. Структура активных центров гуанилспецифичных
РНКаз и их комплексов с нуклеотидами.
4.1. Гуанилспецифичная РНКаза из гриба Рес i п
4.2. Гуанилспецифичная РНКаза из гриба vii Я
4.3. РНКаза i ii 1Р.
5. Исследование механизма действия неспецифичной РНКазы из гриба РепсРРим viix .
6. Топохнмические аспекты структуры активного
центра нуклеазы 9 .
7. Кинетическая специфичность РНКдеполимераз
7.1. Кинетическая специфичность РНКаз в реак
циях гидролиза нуклеозид2,3циклофосфатов
Стр.
7.2. Вторичная специфичность РНКдеполимераз
в реакциях расщепления однонитевых РНК.
7.3. Действие РНКдеполимераз на двуспиральные РНК
вывода.
ЛИТЕРАТУРА


оказывается в близком контакте с фосфатной группой. Таким образом, результаты работы позволяют считать, что структура комплекса А с РНКазой наиболее близко соответствует продуктивному комплексу фермента с субстратом. Конформационные изменения белка вызываются связыванием уридинового фрагмента . iр и приводят к оптимальному для цротекания каталитического акта расположению субстрата и функциональных групп фермента. РНКазы с динуклеозидфосфагом АрС . Обнаружено, что основание и рибозный фрагмент цитидина фиксируются в участках и так же, как и в комплексе А . При этом фосфатная группа связывается неспецифически с белком, а аденозиновый фрагмент динуклеотида экспонирован в растворитель. Решающая роль водородных связей между основанием пиримидиновых нуклеотидов и молекулой белка в образовании специфичных комплексов была подтверждена изучением комплексов РНКазы с 8замещенными пуриновыми нуклеотидами 8о. В качестве лигандов использовались 8оксо, 8 г и 8тио 3 Р. Этот нуклеотид связывался с белком в синконформации. г РНКазы образуются водородные связи подобно тому, как это наблюдалось для комплексов 3 С. МР. В III2 гг. РНКазы А и РНКазы ,. А. Было вновь подтверждено, что структура обоих ферментов очень сходна и практически совпадает в области активного центра. В присутствии иона фосфата в активном центре фермента остатки 5 и V образуют с ним водородные связи. Кроме этого, имидазольное кольцо i1 образует вторую водородную связь с карбоксильной группой остатка 4 , а имидазольное кольцо i 1 с карбонильной группой остатка 7 . Нейтронографический анализ позволил локализовать молекулы воды, иммобилизованные в структуре фермента. Большинство таких молекул обнаружено на поверхности молекулы белка, особенно в области активного центра. Они как правило объединены в кластеры. Три молекулы воды таких кластеров располагаются в углах тетраэдра, остальные позиции которого заняты атомами кислорода и азота, принадлежащими полипептидной цепи белка. Некоторое количество молекул воды находится во внутренней части молекулы фермента и не имеет контактов с раствором. В г. РНКазы А в кристалле методами рентгеноструктурного анализа с разрешением 1, А . В этой работе для расчета координат атомов и визуализации структуры использованы методы компьютерного графопостроения на основе карты электронных плотностей. В следующей работе из той же лаборатории были изучены комплексы РНКазы А с 2 Р, 3 оксид 2 и 8оксо v3Р . В этом исследовании, как и ранее в работе во, показано, что модифицированный пуриновый нуклеотид связывается в синконформации в пиримидинсвязывающем участке фермента. Положения остатков . Подвижность боковой цепи остатка резко ограничивалась и его терминальная аминогруппа находилась в непосредственном контакте с фосфатной группой нуклеотида. фиксировался в соответствующем минорном положении. и , . Л . . Заметных конформационных изменений в участке связывания нуклеозидного фрагмента пиримидиновых нуклеотидов не наблвдается. Рентгеноструктурный анализ молекулы РНКазы в кристалле стимулировал ряд работ по теоретическому конформационному анализу комплексов этого фермента с субстратами и их аналогами. Систематическая работа такого характера была проведена Г. М. Липкиццом и М. Я. Карпейским 9о. Основной задачей этих расчетов было выявление на основе структуры РНКазы потенциальной поверхности связывания субстрата белком и анализ на этой основе возможных конформационных перестроек комплекса. В основе таких расчетов лежит предположение, что наблюдаемая в кристалле молекулярная конформация РНКазы соответствует энергетическому минимуму. Нам представляется важным отметить следующие выводы этих работ. Р3е. изогнуты утлы 00. Н и 0. НА составляют примерно 0. В другой возможной ориентации основания в центре , не сопряженной с образованием водородных связей с остатком , атом сдвинут всегда на I А по сравнению с его предыдущим положением, т.