Гены белков теплового шока дрозофилы. Динамические изменения структуры хроматина при транскрипции

• Автор: Преображенская, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕН.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ ГЕНОВ

1. Электронная микроскопия.

2. Повышенная чувствительность транскрибируемого хроматина к нуклеазам

3. Гиперчувствительность к нуклеазам отдельных районов хроматина

4. Использование микрококковой нуклеазы для анализа нуклеосомной организации хроматина.

5. Заключение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. МАТЕРИАЛЫ.
П. МЕТОДЫ
1. Культура клеток и эмбрионы дрозофилы.
2. Выделение ядер из культуры клеток и эмбрионов дрозофилы
3. Гидролиз ядер нуклеазами и электрофорез фрагментов ДНК.
4. Ковалентное связывание гистонов с ДНК
5. Двумерный электрофорез сшитых ДНКгистоновых комплексов.
6. Приготовление ДБМбумаги и электроперенос фрагментов ДНК на ДБМбумагу.
7. Перенос ДНК на нитроцеллкшозные фильтры
8. Выделение плазмидной ДНК.
9. Расщепление ДНК рестриктазами
. Введение Рметки в ДНК.
. Гибридизация ДНК, фиксированной на ДБМбумаге или нитроцеллкшозных фильтрах, с клонированными пробами
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследованные области генома.
2. Краткая характеристика метода гибридизации с белковыми тенями
3. Содержание гистонов в транскрибируемой области
гена бтш и бтш.
4. Содержание гистонов в 5концевой области гена бтш
5. Содержание гистонов в 3концевой области гена бтш
6. Изменения в структуре хроматина, выявляемые при гидролизе его микрококковой нуклеазой и ДНКазой I.
7. Структурные переходы в хроматине.
ВЫ ВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Стр. СПИСОК СОКРАЩЕН Электронная микроскопия. Использование микрококковой нуклеазы для анализа нуклеосомной организации хроматина. Заключение. I. МАТЕРИАЛЫ. Культура клеток и эмбрионы дрозофилы. Гидролиз ядер нуклеазами и электрофорез фрагментов ДНК. Двумерный электрофорез сшитых ДНКгистоновых комплексов. Приготовление ДБМбумаги и электроперенос фрагментов ДНК на ДБМбумагу. Выделение плазмидной ДНК. Введение Рметки в ДНК. Исследованные области генома. Изменения в структуре хроматина, выявляемые при гидролизе его микрококковой нуклеазой и ДНКазой I. Структурные переходы в хроматине. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структуры хроматина. Известно, что компактная структура хроматина, состоящая из плотнопакованных нуклеосом при транскрипции подвергается существенным изменениям. Транскрибируемые гены проявляют повышенную чувствительность к нуклеазам, в их промоторной области появляются гиперчувствительные к нуклеазам участки. Транскрипция сопровождается также модификацией гистонов и ДНК, появлением специфических негистоновых белков. По данным электронной микроскопии и методов, использующих гидролиз хроматина микрококковой нуклеазой, большинство умеренно транскрибируемых генов сохраняет свою нуклеосомную организацию, однако, интенсивная транскрипция, видимо, приводит к исчезновению нуклеосом. Остается неясным, связано ли это с разворачиванием нуклеосом, с конформационными изменениями, при которых гистоны остаются на ДНК,или же отсутствие нуклеосом вызвано удалением гистонов с активно транскрибируемой ДНК. Данные, имеющиеся в литературе по этому вопрооу и полученные, в основном, с использованием методов электронной микроскопии, противоречивы, так как результаты сильно зависят от способа приготовления препаратов. Работы, в которых сравнивалось содержание гистонов во фракциях хроматина, обогащенных активно транскрибируемыми генами, также не могут считаться убедительными, ибо в процессе фракционирования возможно перераспределение гистонов или их частичная деградация. В нашей работе мы использовали новый подход, позволяющий локализовать белки на специфических последовательностях ДНКметод гибридизации с белковыми тенями. Он разработан на основе пришивки белков к ДНК, после метилирования ее диметилсульфатом и частичной апурикизации. Применение указанного метода позволило нам сравнить содержание гистонов в хроматине различных участков генов белков теплового шока бтш дрозофилы в неактивном состоянии и в случае транскрипции генов. При этом было показано, что 5концевая регуляторная область потенциально активного и активированного транскрибируемого гена бтш всегда свободна от гистонов. Обнаружено, что умеренная транскрипция генов бтш приводит к удалению гистона Н1, а интенсивная транскрипция связана с удалением всех гистонов. Этот эффект распространяется также на 3 прилегающую неструктурную область одного из этих генов. Предполагается, что связанное с транскрипцией последовательное удаление гистонов может приводить к постепенной деконденсации хроматина в менее компактную форму, а затем и в полностью развернутую, свободную от гистонов ДНК.