Исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-дуплексами в растворе

• Автор: Тимченко, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
I. РОЛЬ ОТкВ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА Литературный обзор

1.1. Роль КБкВ в клеточных процессах

1.1.1. Семейство ОТкВ

1.1.2. Роль кВ в иммунном ответе организма и онкогенезе

1.1.3. Сигнальные пути активации МБкВ

1.1.4. Регуляция транскрипционной и ДНКсвязываюгцей активности белка

1.1.4.1. Регуляция активности кВ с помощью фосфорилирования сериновых остатков белка

1.1.4.2. Окислительновосстановительная регуляция активности кВ в клетке

1.1.5. Специфичность узнавания кВ
1.2. Особенности структурной организации кВ и его комплексов с ДНК
1.2.1. Структура р субъединицы кВ
1.2.2. Структура комплекса р субъединицы МБкВ с ДНК
1.2.2.1. Кристаллическая структура комплекса р субъединицы кВсДНК
1.2.2.2. Исследование конформационных особенностей комплекса р субъединицы кВ с ДНК и механизма связывания белка р с ДНК в растворе
II. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСПЕКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ р СУБЪЕДИНИЦЫ С ДНКДУПЛЕКСАМИ В РАСТВОРЕ
Обсуждение результатов
.1. Сравнение физикохимических характеристик рекомбинантных белков и i6
.1.1. Исследование конформации белков и
0i6 в растворе
.12. Анализ структуры белков и i
методом кругового дихроизма
II.1.3. Изучение влияния пептидных довесков на ДНК
связывающий центр белков и i6
.2. Структурные аспекты взаимодействия белка р
с ДНКдуплексами в растворе
.2.1. Структура комплекса белка р с ДНК в растворе
.2.2. Структура ДНКсвязывающего центра белка р
.2.2.1. Изучение влияния замены аминокислотных остатков , и 8 на в белке
р на его структуру
.2.2.2. Изучение влияния замены аминокислотных остатков , и 8 на в белке р на его комплексообразование с ДНК
.2 Изучение влияния замены аминокислотных остатков
, и 8 на в белке р на ДНКсвязывающий центр белка
.3. ПУТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
.3.1. Модифицированные ДНКдуплексм как потенциальные
регуляторы активности кВ в клетке
И.3.2. Ингибирование кВ с помощью антиракового препарата
кобальтфталоцианинового комплекса
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В данной работе впервые с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния проведено исследование конформации белка р кВ в растворе. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния позволяет описать форму молекулы на основе модельных вычислений. Основной вклад в кривую рассеяния вносят общие размеры частицы и их форма. Из кривой рассеяния в этой области можно извлечь информацию об электронном радиусе инерции, молекулярном весе, объеме, площади поверхности, гидратации молекулы и ряде других интегральных характеристик объекта. До настоящего времени исследования структурных особенностей белка р в растворе практически не проводилось. Кристаллическая структура для белка р вне комплекса с лигандами еще не получена. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния также впервые изучены конфирмационные изменения в белке р, происходящие при его комплексообразовании с ДНК. Для исследования изменений в геометрии центра связывания белка при введении единичных замен как в структуру ДНКсвязывающего центра белка р, так и в структуру участка узнавания белка в ДНК впервые использован метод рсгиоселективного ковалентного связывания 5,6, разработанный в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Метод региоселективного ковалентного связывания базируется на создании с помощью химического лигирования синтетических ДПКдуплексов, содержащих в одной из цепей вместо природной межнуклсотидной фосфатной группы химически активную три замещенную пирофосфатную фосфатную группу ТЗПГ. Такие ДНКдуплсксы являются эффективными фосфорилирующими агентами в водной среде и способны образовывать ковалентную связь с нуклеофильными группами аминокислотных остатков , Туг или i НКсвязывающих белков в составе специфического комплекса НКбелок. Необходимым условием образования ковалентной связи между белком и ДНК является стсрическая сближенность реагирующих группировок. Ковалентное связывание белка с серией модифицированных ДНКдуплексов, содержащих химически активную группу в одной из позиций участка узнавания, позволило прозондировать ДНКсвязывающий центр белка. В сочетании с методом сайтнаправленного мутагенеза белка в работе исследовано влияние замены ряда ключевых аминокислот в белке р , участвующих во взаимодействии с фосфатными группами ДНК, на центр связывания белка. ДИК, реализующихся в составе комплекса белка с ДИК, содержащими участки узнавания из разных генов. Изученная возможность картирования центра связывания белков с помощью метода региоселективного ковалентного связывания может найти применение и для других ПКсвязывающих белков. Используемые в работе ТЗПГсодсржащие ДКдуплсксы i быть предложены в качестве специфичных ингибиторов кВ благодаря их свойству селективно и необратимо связываться с белком в условиях i vi. Для анализа специфичности их взаимодействия с кВ в опухолевых клетках в работе проведено ковалентное связывание модифицированных ДНКдуплексов с клеточным пулом кВ в ядерных и цитоплазматических фракциях лизатов клеток карциномы кишки человека II6. Показано, что подобные Д1 Iрсагенты связываются специфично с кВ в лизатах, не заграгивая другие компоненты клетки, что подтверждено иммуноблоттингом с антителами к р и р субъединицам кВ. Кроме того, сделаны предварительные эксперименты по доставке флуорссцентномеченного модифицированного ДИКреагента в опухолевые клетки, и исследована его способность к ковалентному связыванию с кВ в клетке. Методом конфокальной сканирующей микроскопии показано, что такие ДНКдуплексы проникают через цитоплазматическую мембрану и локализуются, в основном, по периферии клетки. При воздействии на клетки фактора некроза опухоли а а, приводящего к запуску сигнальных путей активации кВ, ДНК мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с кВ. Обработка клеток СТ6, предварительно инкубированных с родаминмеченным ДКреагентом, флуорссцсинмечсными антителами к р субъединице кВ выявила колокализацию антител с ДНКдуплексами. Можно предполагать, что ДПКдуплексы образуют специфический комплекс с кВ в клетках.