Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов

• Автор: Шевелев, Алексей Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 195 с. : ил.

Содержание

Список сокращении

1. Введение. Цели и задачи исследования

2. Обзор литературы. Секреция белков у i ii. Свойства секреторных белков

2.1. Введение

2.2. Какие белки секретируются

2.3. Структура сигнального пептида в целом

2.4. Классификация сигнальных пептидов

2.4.1. Идентификация сигнальных пептидов методом компьютерного предсказания

2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся по главному секреторному пути Бессистема

2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя

аргининовыми остатками мотив
2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов
2.4.5. Сигнальные пептиды нрепилиниодобных белков
2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов
2.5. Количество транспортируемых белков
2.6. зависимая секреторная система
2.6.1. Цитозольные шапероны
2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции
2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия
2.6.2. Транслоказа
2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I
2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II
2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов
2.6.6. Внецитоплазматичсские катализаторы фолдинга белков 2.6.6.1Петндилпролил цистранс изомеразы
2.6.6.2. Тиолдисульфид окендоредуктазы
2.6.6.3. Пропептиды
2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга небелковой природы
2.7. Контроль качества транспортируемых белков
2.8. независимый экспорт белков
2.8.1. система транспорта
2.8.2. Система экспорта препилинподобных белков
2.8.3. АВСсистсма транспорта
2.9. Роль пропептида в секреции белков
2 Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке
. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке
. Белки, ковалентно связыванные с клеточной стенкой
2 Транспорт белков во время споруляции
. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции
. Факторы, участвующие в споруляционнозависимом транспорте белков
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.2.1. Выделение нлазмидной ДНК по модифицированному методу БирнбоймаДолли
3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР
3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля методом
3.2.4. Трансформация форм
3.2.5. Адаптация культур форм к росту в жидкой среде
3.2.6. Ферментация рекомбинантных штаммов форм продуцентов и СрТ
3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинантных генов и в клетках форм . iii
3.2.8. электрофорез в ПААГ
3.2.9. Иммунофермеитпый анализ методом Вестернблоттинга
3.2 Анализ аминокислотных последовательностей
3.2 Определение активности глутамилэндопептидазы
3.2 Определение активности карбоксипептидазы Т
3.2 Протеолитическая активация предшественника
3.2 Выделение предшественника из культуральной 3 жидкости форм
3.2 Выделение СрТ из культуральной жидкости форм . iii
3.2 Процессинг секреторной формы СрТ i vi
3.2 Трансформация клеток . i. Ферментация рекомбинантных штаммов . i продуцентов предшественников и СрТ в виде тел включения
3.2 Ренатурация предшественников протеиназ, полученных в виде тел включения
3.2 Трансформация клеток В. ii методом Спицайзена
3.2 Ферментация рекомбинантных штаммов В. ii продуцентов и СрТ
3.2 Выделение геномной ДНК из клеток В. ii и Т. vi
3.2 Разработка нового вектора для экспрессии генов протеиназ в В. ii
3.2 Экспрессия генов глутамилэндопсптидаз в В. ii на основе разработанного вектора
3.2 Использование минигена, кодирующего пентапептид устойчивости к эритромицину, в качестве транскрипционного
репортера в клетках В. ii и формах . iii
4. Результаты и обсуждение
4.1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах
4.2. Гены 6эндотоксинов В. iii
4.3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл
4.4. Изучение структуры и механизма процессинга
предшественников секреторных протеиназ бацилл i vi
4.5. Разработка промышленных продуцентов секреторных
ферментов на базе бацилл с использованием геноврегуляторов
секреторного аппарата
5. Выводы
6. Благодарности
7. Список литературы
ВВЕДЕНИЕ


Далее, петля в Ндомене разворачивается, и таким образом первая часть зрелого белка протаскивается через мембрану. Во время или сразу после транслокации секреторной системой на рисунке не показана сигнальный пептид отщепляется СПазой I типа и в последующем деградирует с участием ПСПазы. После транслокации через мембрану белок принимает свою естественную конформацию. Первый главный класс образован типичными лидерными пептидами, которые присутствуют в пребелках и отщепляются различными СПазами . Хотя большинство белков с подобными сигнальными пептидами, повидимому, секретируются во внешнюю среду, некоторые из них все же удерживаются в клеточной стенке или специфически направляются во внутримембранное пространство эндоспоры после транслокации через мембрану посредством системы. Интересно, что подгруппа этих сигнальных пептидов содержит так называемый мотив с двумя аргининовыми остатками iii i, i, который может направлять белки в другую систему транслокации, известную как система. Второй большой класс сигнальных пептидов присутствует в прелиполротеинах. Отщепляются они липопротеинспецифичными СПазами В. II i. Основное отличие сигнальных пептидов липопротеинов и секреторных белков присутствие высоко консервативного липобокса в предшественниках липопротеинов. Этот липобокс содержит инвариантный остаток цистеина, который модифицируется липидами с участием диацилглицерилтрансферазы до момента процессинга предшественника СПазой типа II. После транслокацни через цитоплазматическую мембрану экспортируемый модифицированный белок остается заякоренным в мембране посредством липида, связанного с концевым цистеиновым остатком. Интересно, что и некоторые сигнальные пептиды липопротеинов содержат типичный мотив. Следовательно, существует возможность экспорта таких липопротеинов скорее через путь, нежели через систему. Третий класс образован сигнальными пептидами препилииподобных белков, которые в В. СПазой , . Последовательность для распознавания препилиновой СПазой локализована, в отличие от секреторных белков и липопротеинов, между и Ндоменами. Таким образом, Ндомен остается присоединенным к зрелому пилину после процессинга лидерного пептида , , , . Наконец, четвертый класс сигнальных пептидов выделяют среди синтезируемых рибосомами бактериоцииов и феромонов, которые транспортируются через АТФсвязывающую систему ii , транспортеры , i . Эти сигнальные пептиды не имеют гидрофобного Ндомсна и отщепляются от зрелого белка субъединицей транспортера, который ответствен за экспорт бактериоцииов и феромонов, либо специфическими СПазами. Хорошо известно, что В. Однако до недавнего времени было трудно оценить число экспортируемых белков, формирующих секретому В. Завершение проекта по секвенированшо генома В. Компьютерный анализ показал, что около протеомы В. Некоторые из этих предполагаемых мембранных белков содержат коицевой сигнальный пептид и в реальности могут оказаться экспортными белками, как будет показано ниже. Для того чтобы оценить число экспортируемых белков, использовались концевыс последовательности всех аннотированных белков В. Этот метод включает в себя и обнаружение возможного сайта отщепления лидерной последовательности, и предсказание наличия или отсутствия сигнального пептида, основанные на комбинации нескольких различных принципов, хорошо зарекомендовавших себя при идентификации сигнальных пептидов белков из различных грамноложительиых бактерий. Далее все предположительные сигнальные пептиды подвергались скринингу на наличие липобокса, мотива или сайта отщепления для препилиновой СПазы. Частота встречаемости и особенности каждого класса секреторных лидеров схематично и обобщенно представлены на Рис. Следует отметить, что политопные мембранные белки, некоторые из которых могут процессироваться СПазами 1типа i . Кроме того, к секреторным могут быть ошибочно причислены белки с одним концевым трансмембранпым доменом, например, некоторые СПазы Iго типа. Наконец, алгоритм i, специально предназначенный для предсказания секреторных лидеров грамположительных эубактерий, может не распознать некоторые сигнальные пептиды В.