Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека

• Автор: Раевская, Наталья Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы

Цели п задачи работы.

Научнаи новизна

Практическая значимость работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные подходы и методы изучения транскринтома

1.1.1. Анализ нуклеотидной сложности мРНК

1.1.2. Нозериблотгибридизация и создание клонотек кДНК.

1.1.3. Компьютерные методы исследования

1.1.4. Широкомасштабные методы исследования экспрессии генов.

1.1.4.1. Метод дифференциального дисплея мРНК.
1.1.4.2. Серийный анализ экспрессии генов.
1.1.4.3. Тотальный анализ экспрессии генов
1.1.4.4. Метод микрочипов.
1.2. Особенности структурной организации и функционирования эукариотических мРНК.
1.2.1. Структурная организация молекулы мРНК.
1.2.2.5НТО и ее роль в регуляции трансляции мРНК.
1.2.2.1. АТОкодоны в 5НГО
1.2.2.2. Короткие рамки считывания
1.2.2.3. Вторичные структуры
1.2.2.4. Нуклеотидные мотивы, участвующие в регуляции трансляции мРНК
1.2.3. Роль ЗНТО мРНК в регуляции экспрессии генов.
1.2.3.1. Регуляция трансляционной активности зранскриптов.
1.2.3.2. Механизмы, контролирующие локализацию мРНК в клетке
1.2.3.3. Регуляция стабильности транскриптов
1.2.4. Особенности структурнофункциональной организации мозгоспецифических мРНК.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Клонирование фрагментов кДНК НшоЬЗ в ДНК фага М.
2.1.1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования.
2.1.2. Среды и растворы.
2.1.3. Выделение рекомбинантной плазмиды ДНК рС со вставкой НтоЬЗ.
2.1.4. Получение однонитевой формы бактериофага М.
2.1.5. Выделение репликативной формы бактериофага М.
2.1.6. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК эндонуклеазами НтсПП и ЕсоЯ1.
2.1.7. Фракционирование ДНК в агарозном геле
2.1.8. Элюция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
2.1.9. Обработка препаратов фаговой ДНК бактериальной щелочной фосфатазой
2.1 Получение рекомбинантных молекул фага М.
2.2. Получение компетентных клеток и высокоэффективная трансформация
2.3. Определение первичной структу ры последовательности НтоЬЗ
2.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов секвенировання ДНК
2.5. Локализация последовательностей Н1Ы и НтоЬЗ на хромосомах
2.5.1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые в реакции Г1ЦР
2.5.2. Полимеразная цепная реакция
2.5.3. Анализ продуктов ПЦР.
2.5.4. ЯНкартирование
2.6. Скрининг коеммдных клонотск
2.7. Получение препаратов космидной ДНК.
2.8. Рестрпктазное картирование ДНК геномных клонов.
2.8.1. Рестрикция ДНК космидных клонов
2.8.2. Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые фильтры НуЬопб
2.8.3. Получение Рмеченого фрагмента ДНК гапботмечение
2.8.4. Гибридизация продуктов рестрикции с меченым зондом.
2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК фрагмента вставки
клона 7 СМЪ.
2.9.1. Клонирование РэИфрагмента геномного клона 7 в плазмиду рВ1ие5Спр1 II
2.9.2. Подготовка образцов для секвенировання.
2.9.3. Автоматическое секвенирование
2 Выделение тотальной РНК.
2 Получение полиАмРНК на олиго1Т целлюлозе
2 Нозернгибридизация.
. Получение Рмечсных зондов
. Электрофоретическое фракционирование РНК в денатурирующем агарозном геле
2 ОТПЦР.
. Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой I.
. Синтез одноцепочечной ДНК
. Условия амплификации.
. Электрофоретическое фракционирование продуктов ОТПЦР
2 Секвениропание продуктов ОТПЦР
2 Блот гибридизация продуктов ОТПЦР
. Получение Р меченого ПЦРзонда
2 Реакция удлинения праймера i xi
. Получение Рмеченого маркера и олигонуклеотидных праймеров.
. Гибридизация меченых праймеров с полиА1 фракцией мРНК.
. Реакция удлинения праймера.
. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции.
2 Полуколичественный анализ
. Получение РНК и кДНК из тканей человека и крыс.
. Полимеразная цепная реакция
. Компьютерная обработка результатов.
2 Программное обеспечение
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Определение первичной структуры последовательности НтоЬЗ
3.2. Нозернгибридизация ДНК клонов и НтоЬЗ.
3.3. Хромосомная локализация последовательностей и НтоЬЗ
3.4. Рестриктазное картирование ДНК геномного клона 7, включающего последовательность
3.5. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК геномного клона
3.6. Физическое картирование в геноме человека
3.7. I ii анализ последовательности
3.8. Выявление протяженной ЗНТО у транскринта гена комплекенна 2.
3.9. Анализ i ii мРНК комнлексина 2.
3 Экзонинтронная организация гена кочплексина 2 человека
3 Выявление двух вариантов транскриптов гена комнлексина 2 с помощью ОТПЦР
3 Исследование ш вШсо промоторных областей гена СРЛХ2 человека
3 Определение точек инициации транскрипции гена СРЬХ2.
3 Эволюционный консерватизм транскриптов гена комплексина 2.1п вШсо идентификация транскриптов комплексина 2 мыши и крысы.
3 Выявление транскриптов гена комплексина 2 в тканях человека и крысы
3 Рестриктазное картирование вставки клона 8, включающей последовательность НшоЬЗ
3 Поиск последовательностей, гомологичных НшоЬЗ.
3 Выявление протяжепиой ЗНТОу транскриита гена МАР1В
3 Поиск регуляторных участков в ЗНТО транскриптов СРБХ2 и МАРШ
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В результате исследования клонированной ранее мозгоспецифической последовательности удалось установить ее принадлежность Зконцевой части гена комплексина 2 X2 человека. Впервые описана детальная структура гена X2 человека, а также изучены особенности организации его транскриптов. РНК гена СРЬХ2. Высказаны предположения о возможных механизмах, регулирующих уровень активности гена СР1Х2 и соответствующего белка в организме. Впервые исследована представленность транскриптов гена в разных отделах мозга человека и крысы. Впервые проведен сравнительный анализ нетранслируемых участков мРНК комплексина 2 между различными видами млекопитающих, показана эволюционная консервативность участка, отвественного за полиаденилирование. Изучение клонированной последовательности НшоЬЗ позволило уточнить структурную организацию 3концевого участка гена МАР1В человека, а также особенности строения ЗНТО его транскриптов. Показано, что изучаемый ген экспрессируется в мозге, почке и скелетной мышце человека. В почке и скелетной мышце также обнаружены новые варианты транскриптов гена МЛР1 В. Результаты исследования, позволившие уточнить структуру генов СР1Х2 и МЛР1В, представляют большой интерес с позиции определения вклада анализируемых генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в том числе и при патологических состояниях. Информация о структурной организации транскриптов генов СР1Х2 и МАР1В является значимой для дальнейшего изучения особенностей транскрипции и трансляции исследуемых генов. Идентификация функциональных элементов в промоторных областях гена СР1Х2, а также в 5 и ЗНТО его транскриптов позволяет сформулировать гипотезы относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к экспериментальным исследованиям влияния этих областей на эффективность его экспрессии. Сведения о характере экспрессии исследуемых генов СР1Х2 и МЛР1В в отдельных тканях могут представлять интерес с точки зрения изучения дальнейшей роли одноименных белков, а также механизмов их взаимодействия с другими белками в исследуемых тканях в норме и при патологии. Основные подходы и методы изучения транскрипто. Первым продуктом реализации генетической информации, заключенной в гене, является РНК. Совокупность индивидуальных молекул РНК, или транскриптом, характеризует в целом набор генов, экспрессирующихся в клетке в данный момент времени. Начало исследованию транскриптомов было заложено более лет назад, когда методы исследования, основанные на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, позволяли изучать пулы РНК в той или иной ткани. Уже в то время о массированной экспрессии генов в мозге свидетельствовал анализ нуклеотидной сложности мРНК. Этот параметр определялся количеством разных типов молекул, содержащихся в популяции РНК, и характеризовал количество белковых продуктов в той или иной ткани. Согласно i и соавт. РНК равна суммарной длине индивидуальных молекул без учета копийности 5. Класс высокой представленности, включающий несколько 1 видов транскриптов, присутствующих в высокой концентрации тысячи копий на клетку. Класс средней представленности, включающий 0 мРНК, каждая из которых содержится в умеренной концентрации сотни копий на клетку и кодирует основные клеточные белки. Класс низкой представленности, содержащий большое число различных видов мРНК от 0 и более, каждой из которых представлен в очень низкой концентрации 1 копий на клетку. Транс крипты классов высокой и средней предст авленности обычно составляют основную массу популяции мРНК и вносят матый вклад в нуклеотидную сложность, в то время как транскрипты класса низкой представленности определяют величину этого параметра 5. Сравнение нуклеотидной сложности популяций мРНК, выделенных из разных органов и тканей, показало, что мРНК головного мозга обладает самой высокой сложностью, и, следовательно, в этом органе особенно велико число экспрессирующихся генов, принадлежащих к классу низкой представленности 4. Для объяснения высокой сложности мРНК мозга в то время были предложены две модели.