Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека

• Автор: Брага, Элеонора Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 281 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Критерии злокачественной трансформации и возникновения опухоли

1.2. Онкогены и генысупрессоры опухолевого роста ТБв

1.3. Нестабильность генома и повреждения онкозначимых генов в опухолях

1.4. Роль метилирования ДНК при онкогенезе

1.4.1. СрСостровки в геноме человека

1.4.2. Гипомстилированис генома опухолей

1.4.3.Гиперметилирование Срвостровков ТБв в опухолях

1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов
1.5. Основные подходы при поиске онкозначимых генов
1.5.1. Анализ аллельных делений и умножения копий гена в опухолях
1.5.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли
1.5.3. Вычитающая гибридизация как способ отбора онкогенов и
1.5.4. Применение микропанелей для скрининга генов, изменяющих копийность, метилирование или экспрессию в опухолях
1.5.5. Анализ метилирования промогорных районов геновкандидатов
на роль ТБО и онкогенов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клоно гека рекомбинантных космид хромосомы
2.2. Клоны хромосомы 3
2.3. Выделение ДНК
2.4. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования
2.5. Получение компетентных клеток Е.соИ ТМ9 и ЭН5а и трансформация плазмидной ДНК
2.6. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК
2.7. Окрашивание фрагментов ДНК в полиакриламидном геле
ПАЛГ азотнокислым серебром.
2.8. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклсотидкиназы фага Т4 и гибридизация по Саузерну
2.9. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2 Определение нуклеотидной последовательности
клонированных фрагментов ДНК
2 Статистическая обрабо тка данных скрининга панелей
2 Определение частоты встречаемости аллей и генотипов
2 Образцы первичных опухолей
2 Клеточные линии опухолей и их культивирование
2 Анализ аллельных дисбалансов I полиморфных маркеров хромосомы Зр в ДНК опухолей
2 Мультиплексная ПЦР для анализа копийности фраг ментов ДНК и картирования гомозиготных делений
2 Анализ метилирования ДНК с применением метил чувствительных рестриктаз
2 Бисульфитная конверсия ДНК
2 Метилспецифичиая полимеразная цепная реакция МСПЦР
2 Бисульфитное секвенирование
2 Компьютерный анализ баз данных проекта серийного
анализа экспрессии генов
2 Выделение 1I
2 Синтез кДНК
2 Полуколичествснная ОТПЦР
2 Количественная ПЦР в реальном времени Г1ЦРРВ
2 Статистические методы при анализе частот I полиморфных маркеров, частот изменения уровня мРНК генов и метилирования промоторных областей
2 Основные компьютерные программы, использованные в работе
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация микросателлитных маркеров на хромосомах 3 и
3.1.1. Микросателлиты на хромосоме
3.1.1.1. Частоты встречаемости и особенности распределения ди, три и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы
3.1.1.2. Субклонирование и определение нуклеотидной последовательности микросателлитов на гетерогенность повторов
3.1.1.3. Полиморфные и маркеры хромосомы
3.1.2. Микросателлиты на хромосоме
3.1.2.1. Частоты встречаемости и особенности распределения микросателлитов в связуощих и прыжковых клонах хромосомы 3 и в космидах из области Зр.
3.1.2.2. Микросателлиты в связующих и прыжковых клонах как маркеры генов структура повторов в некоторых микросателлитах
3.1.2.3. Полиморфные и маркеры хромосомы
3.2. Картирование критичных районов Зр в эпителиальных опухолях пяти видов
3.2.1. Картины аллельного дисбаланса полиморфных маркеров Зр в эпителиальных опухолях
3.2.2. Частота аллельных изменений в разных районах Зр в опухолях пяти видов типы аллельных делений
3.2.3. Критичные районы Зр, общие для опухолей разного происхождения идентификация новой горячей точки МЕСАЗ в районе Зр.
3.2.4. Повышенная частота амплификации аллелей в районе МЕСАЗ
3.2.5. Сужение критичных районов АР и 3р., Зр.
3.2.6. Корреляция частоты аллельных изменений в критичных районах
Зр с прорссией опухолей
3.3. Идентификация потенциальных и онкогенов в районе
МЕСАЗ и других критичных районах Зр
3.3.1. Скрининг кандидатов на роль и онкогенов в районе МЕСЛЗ с помощью программы серийного анализа экспрессии генов

3.3.2. Изменения уровня мРНК генов 1, , X1 МЕСАЗ и 3 в клеточных линиях и первичных опухолях
3.3.3. Гомозиготные делении в области гена XI и умножение копий
гена в опухолях
3.3.4. Изменение содержания альтернативных транскриптов гена
в опухолях
3.3.5. Новый вариант сплайсинга и изменение копийности гена 1 в опухолях
3.3.6. Кандидаты на роль из других ключевых районов Зр изменение уровня мРНК в опухолях и структурные изменения в генах
3.4. Метилирование промоторных областей генов 1,
3 и 1 в эпителиальных опухолях
разной локализации
3.4.1. 1 , 3р.
3.4.2. Кандидат на роль , ген 3 , Зр.
3.4.3. Протоонкоген МЕСАЗ, 3р.
3.4.4. Кандидат на роль протоонкогена 1I МЕСАЗ, Зр.
3.4.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и 5 прогностических онкомаркеров
Заключение. Перспективы дальнейших исследований
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список цитированной литературы


Для большинства онкогенов выявлен повышенный уровень экспрессии РНК и белка в опухолях. Активирующие мутации протоонкогенов доминантны и для их проявления достаточно изменения только одного аллеля гена. Толчком к переходу протоонкогена в онкоген могут служить как точковые мутации, так и амплификация гена, а также хромосомные транслокации, которые могут привести к соединению протоонкогена с другим геном с последующим синтезом нового белка БапскегСагаа, Киселев, . К наиболее часто экспрессируемым в опухолях онкогенам относятся гены семейств туе и газ. Например, мутации часто наблюдаются в кодоне онкогена КгаБ при опухолях толстой кишки и поджелудочной железы, а также в аденокарцииомах легкого Татосян, Зборовская, Белохвостов и Румянцев, . Амплификации наиболее характерны для онкогенов Мтус и сегЬВ. Амплификации Итус наблюдали во многих солидных опухолях рак легкого, желудка, тела матки, нейробластомы. Степень амплификации этого онкогена варьирует от 5 до 0 копий на клетку Татосян, Зборовская, . Высокий уровень амплификации Мтус ассоциирован с агрессивным поведением опухоли и, возможно, связан с усилением общей нестабильности генома, которая может быть вызвана сопутствующей инактивацией Т8С ру гомолога р. Амплификация сегЬВ приводит к его гиперэкспрессии, превышающей норму в десятки раз, и ассоциирована с плохим прогнозом рака молочной железы Зборовская, . К вопросу о сравнении поведения протооикогеноп и для потенциального 3 нами в эпителиальных опухолях выявлены мутации, нарушающие функцию белкового продукта, и в тех же образцах опухолей мы наблюдали повышенный уровень мРНК, как и в случае протоонкогенов Глава 3. Роль метилирования ДНК при онкогенезе. К молекулярногенетическим нарушениям исторически относят повреждения в нуклеогндной последовательности гена или участка генома, которые посредством генетического кода могут изменять первичную аруктуру белка или прекращать его синтез. Однако, еще в начале прошлого столетия были обнаружены наследуемые модификации ДНК, не изменяющие ее нуклеотидной последовательности см. Эти эпигенетические изменения ДНК заключались в метилировании цитидиновых остатков в динуклеотидах. За последнее время выяснилось, что метилирование оказывает влияние на разнообразные процессы в клетке и в организме в целом. Установлено, что метилирование ДНК играет важную роль в процессах дифференциации, развития и старения организма, в функционировании генов иммунной системы, а также в образовании и развитии опухолей i, . Геном млекопитающих можно разделить на две неравные части по уровню метилирования ДНК. Основная часть дииуклеотидов около от общего количества представлена фрагментами по 0 п. Фрагменты в составе обогащенных участков ДНК, и локализованные в 5областях генов, получили название островков i, . Приблизительно генов, содержащих островки, относятся к генам домашнего хозяйства, а представлены тканеспецифичными генами. В большинстве случаев островок включает в себя промоторный район гена и один или более экзонов гена. Самый большой островок покрывает 9 иль и расположен на хромосоме, 2 крупных островка включают по п. В составе некоторых больших островков содержатся гены рибосомальных РЫК и псевдогены рРНК, но они составляют менее 0. Таблица 2. Содержание островков в богатых районах Ii i i, . Плотность распределения островков по хромосомам различна. Большинство хромосом содержит 5 островков на 1 млн. Однако для хромосомы характерна низкая плотность 2. Относительная плотность островков коррелирует с относительной плотностью генов на этих хродюсомах. Показано, что островки чаше находятся в районах начала репликации геномной ДНК полосы, чем в районах конечной стадии репликации полосы ii i i i . У курицы островки сконцентрированы на микрохромосомах, тогда как макрохромосомы бедны генами i, . В геноме мыши кластеризация островков характерна для районов начала репликации полосы, как и у человека . Поскольку островки являются эффективными маркерами генов, то клонирование островков было использовано для идентификации новых генов Окапо .